متابولومیک تشخیص ندول های خوش خیم و بدخیم ریوی با ویژگی بالا با استفاده از تجزیه و تحلیل طیف سنجی جرمی با وضوح بالا سرم بیمار.

تشخیص افتراقی گره های ریوی شناسایی شده توسط توموگرافی کامپیوتری (CT) یک چالش در عمل بالینی است.در اینجا، ما متابولوم جهانی 480 نمونه سرم، از جمله افراد سالم، ندول‌های خوش‌خیم ریه، و مرحله اول آدنوکارسینوم ریه را مشخص می‌کنیم.آدنوکارسینوم ها پروفایل های متابولومیک منحصر به فردی را نشان می دهند، در حالی که ندول های خوش خیم و افراد سالم شباهت بالایی در پروفایل های متابولومیک دارند.در گروه کشف (306 نفر)، مجموعه ای از 27 متابولیت برای افتراق بین ندول های خوش خیم و بدخیم شناسایی شد.AUC مدل تمایز در گروه اعتبار سنجی داخلی (104 = n) و اعتبار سنجی خارجی (111 = n) به ترتیب 0.915 و 0.945 بود.تجزیه و تحلیل مسیر افزایش متابولیت های گلیکولیتیک مرتبط با کاهش تریپتوفان در سرم آدنوکارسینوم ریه را در مقایسه با ندول های خوش خیم و افراد سالم نشان داد و پیشنهاد کرد که جذب تریپتوفان باعث افزایش گلیکولیز در سلول های سرطان ریه می شود.مطالعه ما ارزش بیومارکرهای متابولیت سرم را در ارزیابی خطر ندول های ریوی شناسایی شده توسط CT برجسته می کند.
تشخیص زودهنگام برای بهبود میزان بقای بیماران سرطانی بسیار مهم است.نتایج آزمایش ملی غربالگری سرطان ریه ایالات متحده (NLST) و مطالعه اروپایی نلسون نشان داده است که غربالگری با دوز کم توموگرافی کامپیوتری (LDCT) می تواند مرگ و میر سرطان ریه را در گروه های پرخطر به طور قابل توجهی کاهش دهد.از زمان استفاده گسترده از LDCT برای غربالگری سرطان ریه، بروز یافته های رادیوگرافی اتفاقی ندول های ریوی بدون علامت همچنان رو به افزایش بوده است 4 .ندول های ریوی به عنوان کدورت های کانونی تا قطر 3 سانتی متر تعریف می شوند.ما در ارزیابی احتمال بدخیمی و مقابله با تعداد زیادی از گره‌های ریوی که تصادفاً در LDCT شناسایی شده‌اند، با مشکلاتی مواجه هستیم.محدودیت های CT می تواند منجر به معاینات پی گیری مکرر و نتایج مثبت کاذب شود که منجر به مداخله غیر ضروری و درمان بیش از حد می شود.بنابراین، نیاز به توسعه نشانگرهای زیستی قابل اعتماد و مفید برای شناسایی صحیح سرطان ریه در مراحل اولیه و افتراق بیشتر گره های خوش خیم در تشخیص اولیه وجود دارد.
تجزیه و تحلیل جامع مولکولی خون (سرم، پلاسما، سلول های تک هسته ای خون محیطی)، از جمله ژنومیک، پروتئومیکس یا متیلاسیون DNA، منجر به افزایش علاقه به کشف بیومارکرهای تشخیصی سرطان ریه شده است.در همین حال، رویکردهای متابولومیکس محصولات نهایی سلولی را که تحت تأثیر اقدامات درون زا و برون زا هستند، اندازه گیری می کنند و بنابراین برای پیش بینی شروع و پیامد بیماری به کار می روند.کروماتوگرافی مایع- طیف سنجی جرمی پشت سر هم (LC-MS) به دلیل حساسیت بالا و دامنه دینامیکی زیاد، روشی است که به طور گسترده برای مطالعات متابولومیک استفاده می شود که می تواند متابولیت هایی با خواص فیزیکوشیمیایی متفاوت را پوشش دهد.اگرچه تجزیه و تحلیل متابولومیک جهانی پلاسما/سرم برای شناسایی نشانگرهای زیستی مرتبط با تشخیص سرطان ریه 14، 15، 16، 17 و اثربخشی درمان استفاده شده است، 18 طبقه‌بندی کننده متابولیت سرم برای تمایز بین گره‌های خوش‌خیم و بدخیم ریه هنوز مورد مطالعه قرار گرفته است.-تحقیقات گسترده
آدنوکارسینوم و کارسینوم سلول سنگفرشی دو زیرگروه اصلی سرطان ریه سلول غیر کوچک (NSCLC) هستند.آزمایش های مختلف غربالگری سی تی نشان می دهد که آدنوکارسینوم شایع ترین نوع بافت شناسی سرطان ریه است 1،19،20،21.در این مطالعه، ما از کروماتوگرافی مایع با وضوح بالا با طیف سنجی جرمی (UPLC-HRMS) برای انجام آنالیز متابولومیک در مجموع 695 نمونه سرم، از جمله افراد سالم، گره های ریوی خوش خیم و 3 سانتی متر ≤ CT استفاده کردیم.غربالگری برای مرحله اول آدنوکارسینوم ریه.ما پانلی از متابولیت‌های سرم را شناسایی کردیم که آدنوکارسینوم ریه را از ندول‌های خوش‌خیم و افراد سالم متمایز می‌کند.تجزیه و تحلیل غنی‌سازی مسیر نشان داد که متابولیسم غیرطبیعی تریپتوفان و گلوکز تغییرات رایج در آدنوکارسینوم ریه در مقایسه با ندول‌های خوش‌خیم و افراد سالم است.در نهایت، ما یک طبقه‌بندی متابولیک سرم با ویژگی و حساسیت بالا برای تمایز بین ندول‌های بدخیم و خوش‌خیم ریوی شناسایی‌شده توسط LDCT ایجاد و تأیید کردیم، که ممکن است به تشخیص افتراقی زودهنگام و ارزیابی خطر کمک کند.
در مطالعه حاضر، نمونه‌های سرم همسان با جنس و سن به صورت گذشته‌نگر از 174 فرد سالم، 292 بیمار مبتلا به ندول‌های خوش‌خیم ریوی، و 229 بیمار مبتلا به آدنوکارسینوم ریه مرحله اول جمع‌آوری شد.مشخصات دموگرافیک 695 نفر در جدول تکمیلی 1 نشان داده شده است.
همانطور که در شکل 1a نشان داده شده است، در مجموع 480 نمونه سرم، شامل 174 شاهد سالم (HC)، 170 ندول خوش خیم (BN)، و 136 نمونه مرحله اول آدنوکارسینوم ریه (LA)، در مرکز سرطان دانشگاه سان یات سن جمع آوری شد.همگروهی کشف برای پروفایل متابولومیک غیر هدفمند با استفاده از کروماتوگرافی مایع با عملکرد فوق العاده - طیف سنجی جرمی با وضوح بالا (UPLC-HRMS).همانطور که در شکل تکمیلی 1 نشان داده شده است، متابولیت های دیفرانسیل بین LA و HC، LA و BN برای ایجاد یک مدل طبقه بندی و بررسی بیشتر تجزیه و تحلیل مسیر دیفرانسیل شناسایی شدند.104 نمونه جمع آوری شده توسط مرکز سرطان دانشگاه سان یات سن و 111 نمونه جمع آوری شده توسط دو بیمارستان دیگر به ترتیب در معرض اعتبارسنجی داخلی و خارجی قرار گرفتند.
یک جمعیت مطالعه در گروه اکتشاف که تحت آنالیز متابولومیک سرم جهانی با استفاده از کروماتوگرافی مایع با عملکرد فوق العاده - طیف سنجی جرمی با وضوح بالا (UPLC-HRMS) قرار گرفتند.b تجزیه و تحلیل تفکیک حداقل مربعات جزئی (PLS-DA) متابولوم کل 480 نمونه سرم از گروه مورد مطالعه، از جمله افراد سالم (HC، n = 174)، گره های خوش خیم (BN، n = 170)، و مرحله اول آدنوکارسینوم ریه (لس آنجلس، n = 136).+ESI، حالت یونیزاسیون الکترواسپری مثبت، -ESI، حالت یونیزاسیون الکترواسپری منفی.c-e متابولیت‌هایی با فراوانی متفاوت در دو گروه داده شده (آزمون رتبه‌بندی علامت‌دار Wilcoxon دو دنباله، مقدار p تنظیم شده با نرخ کشف نادرست، FDR <0.05) به رنگ قرمز (تغییر برابری > 1.2) و آبی (تغییر برابری <0.83) نشان داده شده‌اند. .) در تصویر آتشفشان نشان داده شده است.f نقشه حرارتی خوشه‌بندی سلسله مراتبی که تفاوت‌های قابل‌توجهی را در تعداد متابولیت‌های مشروح بین LA و BN نشان می‌دهد.داده های منبع در قالب فایل های داده منبع ارائه می شوند.
متابولوم کل سرم 174 HC، 170 BN و 136 LA در گروه کشف با استفاده از آنالیز UPLC-HRMS تجزیه و تحلیل شد.ما ابتدا نشان می‌دهیم که نمونه‌های کنترل کیفیت (QC) در مرکز یک مدل تحلیل مؤلفه اصلی (PCA) بدون نظارت قرار می‌گیرند و پایداری عملکرد مطالعه فعلی را تأیید می‌کند (شکل تکمیلی 2).
همانطور که در تجزیه و تحلیل متمایز حداقل مربعات جزئی (PLS-DA) در شکل 1 ب نشان داده شده است، متوجه شدیم که تفاوت های واضحی بین LA و BN، LA و HC در حالت های یونیزاسیون الکترواسپری مثبت (+ESI) و منفی (ESI) وجود دارد. .جدا شده.با این حال، تفاوت معنی داری بین BN و HC در شرایط +ESI و -ESI یافت نشد.
ما 382 ویژگی دیفرانسیل بین LA و HC، 231 ویژگی افتراقی بین LA و BN، و 95 ویژگی تفاضلی بین BN و HC پیدا کردیم (آزمون رتبه علامت دار Wilcoxon، FDR <0.05 و تغییر چندگانه >1.2 یا <0.83) (شکل 0.1c-e). )..پیک‌ها بیشتر (داده‌های تکمیلی 3) در برابر یک پایگاه داده (کتابخانه mzCloud/HMDB/Chemspider) با مقدار m/z، زمان ماند و جستجوی طیف جرمی تکه تکه‌سازی (جزئیات شرح داده شده در بخش روش‌ها) 22 شرح داده شدند.در نهایت، 33 و 38 متابولیت مشروح با تفاوت های قابل توجه در فراوانی به ترتیب برای LA در مقابل BN (شکل 1f و جدول تکمیلی 2) و LA در مقابل HC (شکل تکمیلی 3 و جدول تکمیلی 2) شناسایی شدند.در مقابل، تنها 3 متابولیت با تفاوت های قابل توجه در فراوانی در BN و HC شناسایی شدند (جدول تکمیلی 2)، که مطابق با همپوشانی بین BN و HC در PLS-DA است.این متابولیت های متمایز طیف وسیعی از مواد بیوشیمیایی را پوشش می دهند (شکل تکمیلی 4).روی هم رفته، این نتایج تغییرات قابل توجهی را در متابولوم سرم نشان می‌دهد که منعکس‌کننده تبدیل بدخیم سرطان ریه در مراحل اولیه در مقایسه با ندول‌های خوش‌خیم ریه یا افراد سالم است.در همین حال، شباهت متابولوم سرم BN و HC نشان می دهد که ندول های خوش خیم ریوی ممکن است بسیاری از ویژگی های بیولوژیکی را با افراد سالم به اشتراک بگذارند.با توجه به اینکه جهش‌های ژن گیرنده فاکتور رشد اپیدرمی (EGFR) در زیرگروه 23 آدنوکارسینوم ریه رایج است، ما به دنبال تعیین تأثیر جهش‌های محرک بر متابولوم سرم بودیم.سپس مشخصات متابولومیک کلی 72 مورد با وضعیت EGFR در گروه آدنوکارسینوم ریه را تجزیه و تحلیل کردیم.جالب توجه است، ما پروفایل های قابل مقایسه بین بیماران جهش یافته EGFR (41=n) و بیماران نوع وحشی EGFR (31=n) را در تجزیه و تحلیل PCA (شکل تکمیلی 5a) پیدا کردیم.با این حال، ما 7 متابولیت را شناسایی کردیم که فراوانی آنها در بیماران مبتلا به جهش EGFR در مقایسه با بیماران مبتلا به EGFR نوع وحشی (آزمون t، p <0.05 و تغییر برابری > 1.2 یا <0.83) به طور قابل توجهی تغییر کرده بود (شکل تکمیلی 5b).اکثر این متابولیت ها (5 از 7) آسیل کارنیتین هستند که نقش مهمی در مسیرهای اکسیداسیون اسیدهای چرب دارند.
همانطور که در جریان کار نشان داده شده در شکل 2 الف نشان داده شده است، نشانگرهای زیستی برای طبقه بندی گره ها با استفاده از اپراتورهای کمترین انقباض مطلق و انتخاب بر اساس 33 متابولیت تفاضلی شناسایی شده در LA (n = 136) و BN (n = 170) به دست آمد.بهترین ترکیب متغیرها (LASSO) – مدل رگرسیون لجستیک باینری.برای آزمون پایایی مدل از اعتبارسنجی متقاطع ده برابری استفاده شد.انتخاب متغیر و تنظیم پارامتر با یک جریمه بیشینه سازی احتمال با پارامتر λ24 تنظیم می شود.تجزیه و تحلیل متابولومیک جهانی بیشتر به طور مستقل در گروه های اعتبار سنجی داخلی (104 = n) و اعتبار سنجی خارجی (111 = n) انجام شد تا عملکرد طبقه بندی مدل تفکیک کننده آزمایش شود.در نتیجه، 27 متابولیت در مجموعه کشف به عنوان بهترین مدل متمایز با بیشترین مقدار میانگین AUC شناسایی شدند (شکل 2b)، که از میان آنها 9 مورد افزایش فعالیت و 18 متابولیت کاهش فعالیت در LA نسبت به BN داشتند (شکل 2c).
گردش کار برای ساخت یک طبقه‌بندی گره ریوی، شامل انتخاب بهترین پانل متابولیت‌های سرم در مجموعه کشف با استفاده از مدل رگرسیون لجستیک باینری از طریق اعتبارسنجی متقاطع ده برابری و ارزیابی عملکرد پیش‌بینی‌کننده در مجموعه‌های اعتبارسنجی داخلی و خارجی.b آمار اعتبارسنجی متقاطع مدل رگرسیون LASSO برای انتخاب بیومارکر متابولیک.اعداد داده شده در بالا نشان دهنده میانگین تعداد نشانگرهای زیستی انتخاب شده در λ معین است.خط قرمز نقطه چین نشان دهنده میانگین مقدار AUC در لامبدا مربوطه است.نوارهای خطا خاکستری نشان دهنده حداقل و حداکثر مقادیر AUC هستند.خط نقطه چین بهترین مدل را با 27 نشانگر زیستی انتخاب شده نشان می دهد.AUC، ناحیه زیر منحنی مشخصه عملکرد گیرنده (ROC).c تغییرات برابری 27 متابولیت انتخاب شده در گروه LA در مقایسه با گروه BN در گروه کشف.ستون قرمز - فعال سازی.ستون آبی یک کاهش است.منحنی‌های مشخصه عملکرد گیرنده (ROC) که قدرت مدل تفکیک کننده را بر اساس 27 ترکیب متابولیت در مجموعه‌های اکتشاف، داخلی و خارجی نشان می‌دهد.داده های منبع در قالب فایل های داده منبع ارائه می شوند.
یک مدل پیش بینی بر اساس ضرایب رگرسیون وزنی این 27 متابولیت ایجاد شد (جدول تکمیلی 3).تجزیه و تحلیل ROC بر اساس این 27 متابولیت، سطحی زیر منحنی (AUC) 0.933، حساسیت گروه کشف 0.868، و ویژگی 0.859 بود (شکل 2d).در همین حال، در میان 38 متابولیت تفاضلی مشروح شده بین LA و HC، مجموعه ای از 16 متابولیت به AUC 0.902 با حساسیت 0.801 و ویژگی 0.856 در تمایز LA از HC دست یافتند (شکل تکمیلی 6a-c).مقادیر AUC بر اساس آستانه های تغییر برابری مختلف برای متابولیت های متفاوت نیز مقایسه شد.ما دریافتیم که مدل طبقه‌بندی در تمایز بین LA و BN (HC) بهترین عملکرد را داشت، زمانی که سطح تغییر چین روی 1.2 در مقابل 1.5 یا 2.0 تنظیم شد (شکل تکمیلی 7a,b).مدل طبقه بندی، بر اساس 27 گروه متابولیت، بیشتر در گروه های داخلی و خارجی تایید شد.AUC 0.915 (حساسیت 0.867، ویژگی 0.811) برای اعتبار سنجی داخلی و 0.945 (حساسیت 0.810، ویژگی 0.979) برای اعتبار سنجی خارجی (شکل 2e، f) بود.برای ارزیابی کارایی بین آزمایشگاهی، 40 نمونه از گروه خارجی در یک آزمایشگاه خارجی همانطور که در بخش روش‌ها توضیح داده شد، تجزیه و تحلیل شدند.دقت طبقه بندی به AUC 0.925 رسید (شکل تکمیلی 8).از آنجایی که کارسینوم سلول سنگفرشی ریه (LUSC) دومین زیرگروه شایع سرطان ریه سلول غیر کوچک (NSCLC) پس از آدنوکارسینوم ریه (LUAD) است، ما همچنین کاربرد بالقوه تایید شده پروفایل های متابولیک را آزمایش کردیم.BN و 16 مورد LUSC.AUC تمایز بین LUSC و BN 0.776 بود (شکل تکمیلی 9)، که نشان دهنده توانایی ضعیف تر در مقایسه با تمایز بین LUAD و BN است.
مطالعات نشان داده اند که اندازه ندول ها در تصاویر CT با احتمال بدخیمی همبستگی مثبت دارد و عامل تعیین کننده اصلی درمان گره باقی می ماند25،26،27.تجزیه و تحلیل داده‌های گروه بزرگ مطالعه غربالگری NELSON نشان داد که خطر بدخیمی در افراد با گره‌های کمتر از 5 میلی‌متر حتی مشابه افراد بدون گره 28 بود.بنابراین، حداقل اندازه ای که نیاز به مانیتورینگ منظم سی تی دارد 5 میلی متر است، همانطور که توسط انجمن قفسه سینه بریتانیا (BTS) توصیه می شود، و 6 میلی متر، همانطور که توسط انجمن Fleischner توصیه می شود.با این حال، گره‌های بزرگ‌تر از 6 میلی‌متر و بدون ویژگی‌های خوش‌خیم آشکار، که ندول‌های ریوی نامشخص (IPN) نامیده می‌شوند، یک چالش بزرگ در ارزیابی و مدیریت در عمل بالینی باقی می‌مانند30،31.بعداً بررسی کردیم که آیا اندازه گره بر امضاهای متابولومیک با استفاده از نمونه‌های تلفیقی از گروه‌های کشف و اعتبار داخلی تأثیر می‌گذارد یا خیر.با تمرکز روی 27 نشانگر زیستی معتبر، ابتدا پروفایل های PCA متابولوم های زیر 6 میلی متری HC و BN را مقایسه کردیم.ما دریافتیم که بیشتر نقاط داده برای HC و BN همپوشانی دارند و نشان می دهد که سطوح متابولیت سرم در هر دو گروه مشابه است (شکل 3a).نقشه‌های ویژگی در محدوده‌های اندازه‌های مختلف در BN و LA حفظ شدند (شکل 3b، c)، در حالی که یک جدایی بین ندول‌های بدخیم و خوش‌خیم در محدوده 6-20 میلی‌متر مشاهده شد (شکل 3d).این گروه دارای AUC 0.927، ویژگی 0.868، و حساسیت 0.820 برای پیش بینی بدخیمی گره هایی با اندازه 6 تا 20 میلی متر بود (شکل 3e، f).نتایج ما نشان می‌دهد که طبقه‌بندی‌کننده می‌تواند تغییرات متابولیکی ناشی از تبدیل بدخیم اولیه را بدون در نظر گرفتن اندازه گره‌ها ثبت کند.
مقایسه پروفایل های PCA بین گروه های مشخص شده بر اساس طبقه بندی متابولیک 27 متابولیت.CC و BN < 6 میلی متر.b BN < 6 mm در مقابل BN 6-20 mm.در LA 6-20 میلی متر در مقابل LA 20-30 میلی متر.گرم BN 6-20 میلی متر و LA 6-20 میلی متر.GC، n = 174;BN < 6 میلی متر، n = 153;BN 6-20 میلی متر، n = 91.LA 6-20 میلی متر، n = 89.LA 20-30 میلی متر، n = 77. e منحنی مشخصه عملکرد گیرنده (ROC) که عملکرد مدل متمایز را برای گره های 6-20 میلی متر نشان می دهد.f مقادیر احتمال بر اساس مدل رگرسیون لجستیک برای ندول‌های با اندازه 6 تا 20 میلی‌متر محاسبه شد.خط نقطه خاکستری نشان دهنده مقدار قطع بهینه (0.455) است.اعداد بالا نشان دهنده درصد موارد پیش بینی شده برای لس آنجلس است.از آزمون t دانشجوی دو طرفه استفاده کنید.PCA، تجزیه و تحلیل اجزای اصلی.ناحیه AUC زیر منحنی.داده های منبع در قالب فایل های داده منبع ارائه می شوند.
چهار نمونه (61-44 ساله) با اندازه ندول ریوی مشابه (9-7 میلی متر) بیشتر برای نشان دادن عملکرد مدل پیش بینی بدخیمی (شکل 4a, b) انتخاب شدند.در غربالگری اولیه، مورد 1 به عنوان یک ندول جامد با کلسیفیکاسیون، یک ویژگی مرتبط با خوش‌خیم بودن، در حالی که مورد 2 به عنوان یک ندول نیمه جامد نامشخص و بدون ویژگی‌های خوش‌خیم آشکار ارائه شد.سه دور سی تی اسکن پیگیری نشان داد که این موارد در طول یک دوره 4 ساله پایدار مانده و بنابراین ندول های خوش خیم در نظر گرفته می شوند (شکل 4a).در مقایسه با ارزیابی بالینی سی تی اسکن های سریال، تجزیه و تحلیل متابولیت سرم تک شات با مدل طبقه بندی کننده فعلی به سرعت و به درستی این ندول های خوش خیم را بر اساس محدودیت های احتمالی شناسایی کرد (جدول 1).شکل 4b در مورد 3 یک ندول را با علائم انقباض پلور نشان می دهد که اغلب با بدخیمی همراه است.مورد 4 به عنوان یک ندول نیمه جامد نامشخص و بدون شواهدی از علت خوش خیم ارائه شد.همه این موارد بر اساس مدل طبقه بندی کننده بدخیم پیش بینی شدند (جدول 1).ارزیابی آدنوکارسینوم ریه با بررسی هیستوپاتولوژیک پس از جراحی برداشتن ریه نشان داده شد (شکل 4b).برای مجموعه اعتبارسنجی خارجی، طبقه‌بندی‌کننده متابولیک دو مورد از گره‌های ریه نامشخص بزرگ‌تر از 6 میلی‌متر را به دقت پیش‌بینی کرد (شکل تکمیلی 10).
تصاویر سی تی از پنجره محوری ریه دو مورد ندول خوش خیم.در مورد 1، سی تی اسکن پس از 4 سال یک ندول جامد پایدار به اندازه 7 میلی متر با کلسیفیکاسیون در لوب پایین سمت راست را نشان داد.در مورد 2، سی تی اسکن بعد از 5 سال یک ندول پایدار و نیمه جامد با قطر 7 میلی متر را در لوب فوقانی راست نشان داد.b تصاویر سی تی پنجره محوری از ریه ها و مطالعات پاتولوژیک مربوط به دو مورد آدنوکارسینوم مرحله I قبل از برداشتن ریه.مورد 3 یک ندول به قطر 8 میلی متر در لوب فوقانی راست با انقباض پلور نشان داد.مورد 4 یک ندول شیشه ای نیمه جامد به اندازه 9 میلی متر در لوب فوقانی چپ را نشان داد.رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) بافت ریه برداشته شده (نوار مقیاس = 50 میکرومتر) الگوی رشد آسینار آدنوکارسینوم ریه را نشان می دهد.فلش ها ندول های شناسایی شده در تصاویر CT را نشان می دهد.تصاویر H&E تصاویری از چندین میدان میکروسکوپی (بیشتر از 3) هستند که توسط پاتولوژیست بررسی شده اند.
در مجموع، نتایج ما ارزش بالقوه بیومارکرهای متابولیت سرم را در تشخیص افتراقی گره‌های ریوی نشان می‌دهد، که ممکن است هنگام ارزیابی غربالگری CT چالش‌هایی ایجاد کند.
بر اساس یک پانل متابولیت دیفرانسیل معتبر، ما به دنبال شناسایی همبستگی‌های بیولوژیکی تغییرات عمده متابولیک بودیم.تجزیه و تحلیل غنی‌سازی مسیر KEGG توسط MetaboAnalyst، 6 مسیر مشترک به‌طور قابل‌توجهی را بین دو گروه مشخص شناسایی کرد (LA در مقابل HC و LA در مقابل BN، P≤ 0.001، اثر > 0.01).این تغییرات با اختلال در متابولیسم پیروات، متابولیسم تریپتوفان، متابولیسم نیاسین و نیکوتین آمید، گلیکولیز، چرخه TCA و متابولیسم پورین مشخص شد (شکل 5a).سپس ما متابولومیک های هدفمند را برای تأیید تغییرات عمده با استفاده از کمی سازی مطلق انجام دادیم.تعیین متابولیت های رایج در مسیرهای معمولاً تغییر یافته توسط طیف سنجی جرمی چهار قطبی سه گانه (QQQ) با استفاده از استانداردهای متابولیت معتبر.مشخصات دموگرافیک نمونه مورد نظر مطالعه متابولومیک در جدول تکمیلی 4 آمده است. مطابق با نتایج متابولومیک جهانی ما، تجزیه و تحلیل کمی تأیید کرد که هیپوگزانتین و گزانتین، پیرووات و لاکتات در LA در مقایسه با BN و HC افزایش یافته اند (شکل 5b, c, p <0.05).با این حال، هیچ تفاوت قابل توجهی در این متابولیت ها بین BN و HC یافت نشد.
تجزیه و تحلیل غنی‌سازی مسیر KEGG متابولیت‌های متفاوت قابل‌توجهی در گروه LA در مقایسه با گروه‌های BN و HC.از یک آزمایش جهانی دو طرفه استفاده شد و مقادیر p با استفاده از روش Holm-Bonferroni تنظیم شد (001/0 p≤ و اندازه اثر > 01/0 تنظیم شده).b-d نمودارهای ویولن نشان دهنده سطوح هیپوگزانتین، گزانتین، لاکتات، پیرووات و تریپتوفان در سرمی HC، BN، و LA که توسط LC-MS/MS تعیین شد (70=n در هر گروه).خطوط نقطه چین سفید و سیاه به ترتیب نشان دهنده میانه و چارک هستند.نمودار ویولن نشان دهنده بیان نرمال Log2TPM (رونوشت در میلیون) mRNA ژن SLC7A5 و QPRT در آدنوکارسینوم ریه (n = 513) در مقایسه با بافت طبیعی ریه (n = 59) در مجموعه داده LUAD-TCGA.کادر سفید نشان دهنده محدوده بین چارکی، خط سیاه افقی در مرکز نشان دهنده میانه، و خط سیاه عمودی که از کادر امتداد یافته است نشان دهنده فاصله اطمینان 95٪ (CI) است.f نمودار همبستگی پیرسون بیان SLC7A5 و GAPDH در آدنوکارسینوم ریه (n = 513) و بافت طبیعی ریه (n = 59) در مجموعه داده TCGA.ناحیه خاکستری 95% CI را نشان می دهد.r، ضریب همبستگی پیرسون.g سطح تریپتوفان سلولی نرمال شده در سلول های A549 ترانسفکت شده با کنترل غیراختصاصی shRNA (NC) و shSLC7A5 (Sh1، Sh2) تعیین شده توسط LC-MS/MS.تجزیه و تحلیل آماری از پنج نمونه بیولوژیکی مستقل در هر گروه ارائه شده است.h سطوح سلولی NADt (کل NAD، از جمله NAD+ و NADH) در سلول‌های A549 (NC) و سلول‌های SLC7A5، سلول‌های A549 را از بین می‌برند (Sh1، Sh2).تجزیه و تحلیل آماری از سه نمونه بیولوژیکی مستقل در هر گروه ارائه شده است.فعالیت گلیکولیتیک سلول های A549 قبل و بعد از ناک داون SLC7A5 با نرخ اسیدی خارج سلولی (ECAR) اندازه گیری شد (4 نمونه مستقل بیولوژیکی در هر گروه).2-DG،2-دئوکسی-D-گلوکز.آزمون t دانشجوی دو دم در (b–h) استفاده شد.در (g-i)، نوارهای خطا نشان دهنده میانگین ± انحراف معیار است، هر آزمایش سه بار به طور مستقل انجام شد و نتایج مشابه بود.داده های منبع در قالب فایل های داده منبع ارائه می شوند.
با توجه به تاثیر قابل توجه تغییر متابولیسم تریپتوفان در گروه LA، ما همچنین سطوح تریپتوفان سرم را در گروه های HC، BN و LA با استفاده از QQQ ارزیابی کردیم.ما دریافتیم که تریپتوفان سرم در LA در مقایسه با HC یا BN کاهش یافته است (p<0.001، شکل 5d)، که با یافته های قبلی که سطوح تریپتوفان در گردش در بیماران مبتلا به سرطان ریه کمتر از افراد سالم از گروه کنترل است، مطابقت دارد 33،34 , 35.مطالعه دیگری با استفاده از ردیاب PET/CT 11C-methyl-L-تریپتوفان نشان داد که زمان ماندگاری سیگنال تریپتوفان در بافت سرطان ریه در مقایسه با ضایعات خوش خیم یا بافت طبیعی به طور قابل توجهی افزایش یافته است.ما فرض می کنیم که کاهش تریپتوفان در سرم LA ممکن است منعکس کننده جذب فعال تریپتوفان توسط سلول های سرطان ریه باشد.
همچنین مشخص شده است که محصول نهایی مسیر کینورنین کاتابولیسم تریپتوفان NAD+37،38 است که یک بستر مهم برای واکنش گلیسرآلدئید-3-فسفات با 1،3-بیس فسفوگلیسرات در گلیکولیز است.در حالی که مطالعات قبلی بر نقش کاتابولیسم تریپتوفان در تنظیم ایمنی متمرکز شده‌اند، ما به دنبال روشن کردن تأثیر متقابل بین اختلال در تنظیم تریپتوفان و مسیرهای گلیکولیتیک مشاهده‌شده در مطالعه حاضر هستیم.خانواده ناقل املاح 7 عضو 5 (SLC7A5) به عنوان یک ناقل تریپتوفان 43،44،45 شناخته شده است.کینولینیک اسید فسفریبوزیل ترانسفراز (QPRT) آنزیمی است که در پایین دست مسیر کینورنین قرار دارد و اسید کینولینیک را به NAMN46 تبدیل می کند.بازرسی مجموعه داده LUAD TCGA نشان داد که هر دو SLC7A5 و QPRT در بافت تومور در مقایسه با بافت طبیعی به طور قابل توجهی تنظیم مثبت داشتند (شکل 5e).این افزایش در مراحل I و II و همچنین مراحل III و IV آدنوکارسینوم ریه (شکل تکمیلی 11) مشاهده شد که نشان دهنده اختلالات اولیه در متابولیسم تریپتوفان مرتبط با تومورزایی است.
علاوه بر این، مجموعه داده LUAD-TCGA یک همبستگی مثبت بین بیان mRNA SLC7A5 و GAPDH در نمونه های بیماران سرطانی نشان داد (r = 0.45، p = 1.55E-26، شکل 5f).در مقابل، هیچ ارتباط معناداری بین چنین امضاهای ژنی در بافت طبیعی ریه یافت نشد (r = 0.25، p = 0.06، شکل 5f).از بین رفتن SLC7A5 (شکل تکمیلی 12) در سلول های A549 به طور قابل توجهی سطوح تریپتوفان و NAD(H) سلولی را کاهش داد (شکل 5g,h)، و در نتیجه فعالیت گلیکولیتیک ضعیف شده توسط نرخ اسیدی شدن خارج سلولی (ECAR) اندازه گیری شد (شکل 1).5i).بنابراین، بر اساس تغییرات متابولیک در سرم و تشخیص آزمایشگاهی، ما فرض می‌کنیم که متابولیسم تریپتوفان ممکن است NAD+ را از طریق مسیر کینورنین تولید کند و نقش مهمی در ترویج گلیکولیز در سرطان ریه داشته باشد.
مطالعات نشان داده اند که تعداد زیادی از ندول های ریوی نامشخص شناسایی شده توسط LDCT ممکن است به نیاز به آزمایش های اضافی مانند PET-CT، بیوپسی ریه و درمان بیش از حد به دلیل تشخیص مثبت کاذب بدخیمی منجر شود. مطالعه ما پانلی از متابولیت‌های سرم را با ارزش تشخیصی بالقوه شناسایی کرد که ممکن است طبقه‌بندی خطر و مدیریت بعدی ندول‌های ریوی شناسایی شده توسط CT را بهبود بخشد.
گره‌های ریوی با استفاده از توموگرافی کامپیوتری با دوز پایین (LDCT) با ویژگی‌های تصویربرداری حاکی از دلایل خوش‌خیم یا بدخیم ارزیابی می‌شوند.نتیجه نامشخص ندول‌ها می‌تواند منجر به ویزیت‌های مکرر، مداخلات غیر ضروری و درمان بیش از حد شود.گنجاندن طبقه‌بندی‌کننده‌های متابولیک سرم با ارزش تشخیصی ممکن است ارزیابی خطر و مدیریت بعدی ندول‌های ریوی را بهبود بخشد.توموگرافی انتشار پوزیترون PET.
داده های حاصل از مطالعه NLST ایالات متحده و مطالعه NELSON اروپایی نشان می دهد که غربالگری گروه های پرخطر با توموگرافی کامپیوتری با دوز پایین (LDCT) ممکن است مرگ و میر ناشی از سرطان ریه را کاهش دهد.با این حال، ارزیابی خطر و مدیریت بالینی بعدی تعداد زیادی از ندول‌های ریوی اتفاقی شناسایی‌شده توسط LDCT چالش‌برانگیزترین هستند.هدف اصلی بهینه‌سازی طبقه‌بندی صحیح پروتکل‌های مبتنی بر LDCT با ترکیب نشانگرهای زیستی قابل اعتماد است.
بیومارکرهای مولکولی خاصی، مانند متابولیت های خون، با مقایسه سرطان ریه با افراد سالم شناسایی شده اند.در مطالعه حاضر، ما بر روی استفاده از تجزیه و تحلیل متابولومیک سرم برای تمایز بین ندول‌های ریوی خوش‌خیم و بدخیم که تصادفاً توسط LDCT شناسایی شده‌اند، تمرکز کردیم.ما متابولوم سرم جهانی نمونه‌های کنترل سالم (HC)، ندول‌های خوش‌خیم ریه (BN) و مرحله اول آدنوکارسینوم ریه (LA) را با استفاده از آنالیز UPLC-HRMS مقایسه کردیم.ما دریافتیم که HC و BN پروفایل های متابولیکی مشابهی داشتند، در حالی که LA تغییرات قابل توجهی در مقایسه با HC و BN نشان داد.ما دو مجموعه از متابولیت‌های سرم را شناسایی کردیم که LA را از HC و BN متمایز می‌کنند.
طرح شناسایی فعلی مبتنی بر LDCT برای ندول های خوش خیم و بدخیم عمدتاً بر اساس اندازه، تراکم، مورفولوژی و سرعت رشد گره ها در طول زمان است.مطالعات قبلی نشان داده اند که اندازه گره ها ارتباط نزدیکی با احتمال سرطان ریه دارد.حتی در بیماران پرخطر، خطر بدخیمی در گره های کمتر از 6 میلی متر کمتر از 1 درصد است.خطر بدخیمی برای ندول هایی با اندازه 6 تا 20 میلی متر از 8 تا 64 درصد 30 متغیر است.بنابراین، انجمن Fleischner قطر برش 6 میلی متر را برای پیگیری معمول سی تی توصیه می کند.29 با این حال، ارزیابی خطر و مدیریت گره های ریوی نامشخص (IPN) بزرگتر از 6 میلی متر به اندازه کافی انجام نشده است 31 .مدیریت فعلی بیماری مادرزادی قلب معمولاً مبتنی بر انتظار مراقب با نظارت مکرر CT است.
بر اساس متابولوم تایید شده، ما برای اولین بار همپوشانی امضاهای متابولومیک بین افراد سالم و ندول های خوش خیم کمتر از 6 میلی متر را نشان دادیم.شباهت بیولوژیکی با یافته های قبلی CT مطابقت دارد که خطر بدخیمی برای ندول های کمتر از 6 میلی متر به اندازه افراد بدون گره کم است. شباهت در پروفایل های متابولومیک، نشان می دهد که تعریف عملکردی علت خوش خیم بدون توجه به اندازه ندول سازگار است.بنابراین، پانل‌های متابولیت سرم تشخیصی مدرن ممکن است زمانی که گره‌ها در ابتدا در CT تشخیص داده می‌شوند، یک سنجش منفرد را به‌عنوان یک آزمایش رد کردن ارائه دهند و به طور بالقوه نظارت سریال را کاهش دهند.در همان زمان، همان پانل بیومارکرهای متابولیک، ندول‌های بدخیم با اندازه ≥6 میلی‌متر را از ندول‌های خوش‌خیم متمایز کردند و پیش‌بینی‌های دقیقی را برای IPN‌هایی با اندازه مشابه و ویژگی‌های مورفولوژیکی مبهم در تصاویر CT ارائه کردند.این طبقه‌بندی‌کننده متابولیسم سرم در پیش‌بینی بدخیمی ندول‌های ≥6 میلی‌متر با AUC 0.927 به خوبی عمل کرد.روی هم رفته، نتایج ما نشان می‌دهد که امضاهای متابولومیک سرم منحصربه‌فرد ممکن است به طور خاص منعکس‌کننده تغییرات متابولیکی اولیه ناشی از تومور باشد و ارزش بالقوه‌ای به‌عنوان پیش‌بینی‌کننده خطر، مستقل از اندازه ندول داشته باشد.
شایان ذکر است، آدنوکارسینوم ریه (LUAD) و کارسینوم سلول سنگفرشی (LUSC) انواع اصلی سرطان ریه سلول غیر کوچک (NSCLC) هستند.با توجه به اینکه LUSC به شدت با مصرف تنباکو مرتبط است47 و LUAD رایج ترین بافت شناسی گره های اتفاقی ریه است که در غربالگری CT شناسایی شده است، مدل طبقه بندی کننده ما به طور خاص برای نمونه های آدنوکارسینومای مرحله I ساخته شده است.وانگ و همکارانش همچنین بر LUAD تمرکز کردند و با استفاده از لیپیدومیکس 9 امضای لیپیدی را برای تشخیص سرطان ریه در مراحل اولیه از افراد سالم شناسایی کردند.ما مدل طبقه‌بندی‌کننده فعلی را روی 16 مورد مرحله I LUSC و 74 ندول خوش‌خیم آزمایش کردیم و دقت پیش‌بینی LUSC پایین (AUC 0.776) را مشاهده کردیم، که نشان می‌دهد LUAD و LUSC ممکن است علائم متابولومیک خود را داشته باشند.در واقع، نشان داده شده است که LUAD و LUSC در سبب شناسی، منشا بیولوژیکی و انحرافات ژنتیکی متفاوت هستند.بنابراین، سایر انواع بافت شناسی باید در مدل های آموزشی برای تشخیص مبتنی بر جمعیت سرطان ریه در برنامه های غربالگری گنجانده شود.
در اینجا، ما شش مسیر متداول تغییر یافته در آدنوکارسینوم ریه را در مقایسه با افراد سالم و ندول های خوش خیم شناسایی کردیم.زانتین و هیپوگزانتین متابولیت های رایج مسیر متابولیک پورین هستند.مطابق با نتایج ما، واسطه های مرتبط با متابولیسم پورین در سرم یا بافت های بیماران مبتلا به آدنوکارسینوم ریه در مقایسه با افراد سالم یا بیماران در مرحله پیش تهاجمی به طور قابل توجهی افزایش یافت.افزایش سطح سرمی گزانتین و هیپوگزانتین ممکن است منعکس کننده آنابولیسم مورد نیاز سلول های سرطانی در حال تکثیر سریع باشد.اختلال در متابولیسم گلوکز یکی از مشخصه های شناخته شده متابولیسم سرطان است.در اینجا، ما افزایش قابل توجهی در پیروات و لاکتات را در گروه LA در مقایسه با گروه HC و BN مشاهده کردیم که با گزارش‌های قبلی ناهنجاری‌های مسیر گلیکولیتیک در پروفایل‌های متابولوم سرم بیماران سرطان ریه سلول غیر کوچک (NSCLC) مطابقت دارد. کنترل های سالمنتایج 52،53 سازگار است.
نکته مهم، ما یک همبستگی معکوس بین متابولیسم پیروات و تریپتوفان در سرم آدنوکارسینوم ریه مشاهده کردیم.سطح سرمی تریپتوفان در گروه LA در مقایسه با گروه HC یا BN کاهش یافت.جالب توجه است، یک مطالعه در مقیاس بزرگ قبلی با استفاده از یک کوهورت آینده نگر نشان داد که سطوح پایین تریپتوفان در گردش با افزایش خطر ابتلا به سرطان ریه مرتبط است 54 .تریپتوفان یک اسید آمینه ضروری است که ما به طور کامل از غذا دریافت می کنیم.نتیجه می گیریم که کاهش تریپتوفان سرم در آدنوکارسینوم ریه ممکن است منعکس کننده تخلیه سریع این متابولیت باشد.به خوبی شناخته شده است که محصول نهایی کاتابولیسم تریپتوفان از طریق مسیر کینورنین منبع سنتز de novo NAD + است.از آنجایی که NAD+ عمدتاً از طریق مسیر نجات تولید می‌شود، اهمیت NAD+ در متابولیسم تریپتوفان در سلامت و بیماری هنوز مشخص نیست.تجزیه و تحلیل ما از پایگاه داده TCGA نشان داد که بیان ناقل املاح ناقل تریپتوفان 7A5 (SLC7A5) به طور قابل توجهی در آدنوکارسینوم ریه در مقایسه با گروه کنترل عادی افزایش یافته است و با بیان آنزیم گلیکولیتیک GAPDH همبستگی مثبت دارد.مطالعات قبلی عمدتاً بر نقش کاتابولیسم تریپتوفان در سرکوب پاسخ ایمنی ضد توموری متمرکز شده‌اند.در اینجا نشان می‌دهیم که مهار جذب تریپتوفان با از بین بردن SLC7A5 در سلول‌های سرطانی ریه منجر به کاهش متعاقب سطوح NAD سلولی و کاهش همزمان فعالیت گلیکولیتیک می‌شود.به طور خلاصه، مطالعه ما یک مبنای بیولوژیکی برای تغییرات در متابولیسم سرم مرتبط با تبدیل بدخیم آدنوکارسینوم ریه فراهم می کند.
جهش EGFR شایع ترین جهش محرک در بیماران مبتلا به NSCLC است.در مطالعه ما، ما متوجه شدیم که بیماران مبتلا به جهش EGFR (41 نفر) پروفایل های متابولومیک کلی مشابه بیماران مبتلا به EGFR نوع وحشی داشتند (31 نفر)، اگرچه ما کاهش سطح سرمی برخی از بیماران جهش یافته EGFR را در بیماران آسیلکارنیتین پیدا کردیم.عملکرد ثابت آسیل کارنیتین ها انتقال گروه های آسیل از سیتوپلاسم به ماتریکس میتوکندری است که منجر به اکسیداسیون اسیدهای چرب برای تولید انرژی می شود.مطابق با یافته های ما، یک مطالعه اخیر همچنین پروفایل های متابولوم مشابهی را بین تومورهای جهش یافته EGFR و نوع وحشی EGFR با تجزیه و تحلیل متابولوم جهانی 102 نمونه بافت آدنوکارسینوم ریه شناسایی کرد.جالب توجه است که محتوای آسیل کارنیتین در گروه جهش یافته EGFR نیز یافت شد.بنابراین، اینکه آیا تغییرات در سطوح آسیل کارنیتین منعکس کننده تغییرات متابولیکی ناشی از EGFR و مسیرهای مولکولی زیربنایی است یا خیر، ممکن است مستحق مطالعه بیشتر باشد.
در نتیجه، مطالعه ما یک طبقه‌بندی متابولیک سرم برای تشخیص افتراقی گره‌های ریوی ایجاد می‌کند و جریان کاری را پیشنهاد می‌کند که می‌تواند ارزیابی خطر را بهینه کند و مدیریت بالینی را بر اساس غربالگری سی‌تی اسکن تسهیل کند.
این مطالعه توسط کمیته اخلاق بیمارستان سرطان دانشگاه سان یات سن، اولین بیمارستان وابسته دانشگاه سان یات سن و کمیته اخلاق بیمارستان سرطان دانشگاه ژنگژو تایید شد.در گروه‌های کشف و اعتبارسنجی داخلی، 174 سرم از افراد سالم و 244 سرم از ندول‌های خوش‌خیم از افرادی که تحت معاینات پزشکی سالانه در بخش کنترل و پیشگیری سرطان، مرکز سرطان دانشگاه سان یات سن و 166 ندول خوش‌خیم بودند، جمع‌آوری شد.سرمآدنوکارسینوم ریه مرحله اول از مرکز سرطان دانشگاه سان یات سن جمع آوری شد.در گروه اعتبارسنجی خارجی، 48 مورد ندول خوش خیم، 39 مورد آدنوکارسینوم ریه مرحله I از اولین بیمارستان وابسته دانشگاه سان یات سن، و 24 مورد آدنوکارسینوم ریه مرحله اول از بیمارستان سرطان ژنگژو وجود داشت.مرکز سرطان دانشگاه سان یات سن نیز 16 مورد سرطان ریه سلول سنگفرشی مرحله اول را برای آزمایش توانایی تشخیصی طبقه‌بندی متابولیک ایجاد شده جمع‌آوری کرد (ویژگی‌های بیمار در جدول تکمیلی 5 نشان داده شده است).نمونه‌هایی از گروه کشف و کوهورت اعتبارسنجی داخلی بین ژانویه 2018 و مه 2020 جمع‌آوری شد. نمونه‌هایی برای گروه اعتبارسنجی خارجی بین اوت 2021 تا اکتبر 2022 جمع‌آوری شد. برای به حداقل رساندن سوگیری جنسیتی، تقریباً تعداد مساوی از موارد مرد و زن به هر کدام اختصاص داده شد. گروهتیم کشف و تیم بررسی داخلی.جنسیت شرکت کننده بر اساس خود گزارشی تعیین شد.رضایت آگاهانه از همه شرکت کنندگان اخذ شد و هیچ غرامتی ارائه نشد.افراد مبتلا به ندول‌های خوش‌خیم آن‌هایی بودند که نمره سی‌تی‌اسکن پایدار در 2 تا 5 سال در زمان آنالیز داشتند، به جز 1 مورد از نمونه اعتبارسنجی خارجی، که قبل از عمل جمع‌آوری شد و با هیستوپاتولوژی تشخیص داده شد.به استثنای برونشیت مزمن.موارد آدنوکارسینوم ریه قبل از برداشتن ریه جمع آوری و با تشخیص پاتولوژیک تایید شد.نمونه های خون ناشتا در لوله های جداسازی سرم بدون هیچ گونه ضد انعقاد جمع آوری شد.نمونه های خون به مدت 1 ساعت در دمای اتاق لخته شدند و سپس در 2851 × g به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شدند تا مایع رویی سرم جمع آوری شود.مقدار کمی از سرم در 80- درجه سانتی گراد تا استخراج متابولیت منجمد شد.بخش پیشگیری از سرطان و معاینه پزشکی مرکز سرطان دانشگاه سان یات سن مجموعه‌ای از سرم را از 100 اهداکننده سالم، از جمله تعداد مساوی مرد و زن 40 تا 55 ساله، جمع‌آوری کرد.حجم مساوی از هر نمونه اهداکننده مخلوط شد، استخر حاصل از آن جدا شد و در دمای 80- درجه سانتی گراد نگهداری شد.مخلوط سرم به عنوان ماده مرجع برای کنترل کیفیت و استانداردسازی داده ها استفاده شد.
سرم مرجع و نمونه های آزمایش ذوب شده و متابولیت ها با استفاده از روش استخراج ترکیبی (MTBE/ متانول/آب) استخراج شدند.به طور خلاصه، 50 میکرولیتر سرم با 225 میکرولیتر متانول سرد یخی و 750 میکرولیتر متیل ترت بوتیل اتر سرد یخی (MTBE) مخلوط شد.مخلوط را هم بزنید و به مدت 1 ساعت روی یخ قرار دهید.سپس نمونه ها مخلوط شدند و با 188 میکرولیتر آب با درجه MS حاوی استانداردهای داخلی (13C-لاکتات، 13C3-پیروات، 13C-متیونین و 13C6-ایزولوسین، خریداری شده از آزمایشگاه ایزوتوپ کمبریج) مخلوط شدند.سپس مخلوط در 15000 × گرم به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شد و فاز پایین به دو لوله (هر کدام 125 میکرولیتر) برای تجزیه و تحلیل LC-MS در حالت های مثبت و منفی منتقل شد.در نهایت، نمونه در یک متمرکز کننده خلاء با سرعت بالا تا خشک شدن تبخیر شد.
متابولیت های خشک شده در 120 میکرولیتر استونیتریل 80 درصد بازسازی شدند، به مدت 5 دقیقه گرداب شدند و در 15000 × گرم به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شدند.مواد رویی برای مطالعات متابولومیک به ویال‌های شیشه‌ای کهربایی با ریز درج‌ها منتقل شدند.تجزیه و تحلیل متابولومیک غیر هدفمند بر روی یک پلت فرم کروماتوگرافی مایع فوق العاده با وضوح بالا طیف سنجی جرمی (UPLC-HRMS).متابولیت ها با استفاده از سیستم Dionex Ultimate 3000 UPLC و ستون ACQUITY BEH Amide (2.1 × 100 میلی متر، 1.7 میکرومتر، آب) جدا شدند.در حالت یون مثبت، فازهای متحرک 95٪ (A) و 50٪ استونیتریل (B) بودند که هر کدام حاوی 10 میلی مول در لیتر استات آمونیوم و 0.1٪ اسید فرمیک بود.در حالت منفی، فازهای متحرک A و B به ترتیب حاوی 95% و 50% استونیتریل بودند، هر دو فاز حاوی 10 میلی مول در لیتر استات آمونیوم، pH = 9. برنامه گرادیان به شرح زیر بود: 0-0.5 دقیقه، 2% B.0.5-12 دقیقه، 2-50٪ B.12-14 دقیقه، 50-98٪ B;14-16 دقیقه، 98٪ B;16-16.1.دقیقه، 98 -2٪ B;16.1-20 دقیقه، 2٪ B. ستون در 40 درجه سانتیگراد و نمونه در دمای 10 درجه سانتیگراد در نمونه برداری خودکار نگهداری شد.سرعت جریان 0.3 میلی لیتر در دقیقه، حجم تزریق 3 میکرولیتر بود.یک طیف‌سنج جرمی Orbitrap Q-Exactive (Thermo Fisher Scientific) با منبع یونیزاسیون الکترواسپری (ESI) در حالت اسکن کامل و همراه با حالت نظارت ddMS2 برای جمع‌آوری حجم زیادی از داده‌ها استفاده شد.پارامترهای MS به شرح زیر تنظیم شدند: ولتاژ پاشش +3.8 کیلو ولت/- 3.2 کیلو ولت، دمای مویرگی 320 درجه سانتی گراد، گاز محافظ 40 arb، گاز کمکی 10 arb، دمای هیتر پروب 350 درجه سانتی گراد، محدوده اسکن 70-1050 متر در ساعت، وضوح.70 000. داده ها با استفاده از Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific) به دست آمد.
برای ارزیابی کیفیت داده‌ها، نمونه‌های کنترل کیفیت ترکیبی (QC) با حذف 10 میکرولیتر از مایع رویی از هر نمونه تولید شد.شش تزریق نمونه کنترل کیفیت در ابتدای توالی تحلیلی برای ارزیابی پایداری سیستم UPLC-MS مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.نمونه های کنترل کیفیت سپس به صورت دوره ای وارد دسته می شوند.تمام 11 دسته نمونه سرم در این مطالعه با LC-MS آنالیز شدند.مقدار کمی از مخلوط استخر سرم از 100 اهداکننده سالم به عنوان ماده مرجع در دسته های مربوطه برای نظارت بر فرآیند استخراج و تنظیم اثرات دسته به دسته استفاده شد.تجزیه و تحلیل متابولومیک غیر هدفمند از کوهورت کشف، کوهورت اعتبار سنجی داخلی و کوهورت اعتبار سنجی خارجی در مرکز متابولومیک دانشگاه سان یات سن انجام شد.آزمایشگاه خارجی مرکز تجزیه و تحلیل و آزمایش دانشگاه فناوری گوانگدونگ نیز 40 نمونه از گروه خارجی را برای آزمایش عملکرد مدل طبقه‌بندی‌کننده تجزیه و تحلیل کرد.
پس از استخراج و بازسازی، کمیت مطلق متابولیت‌های سرم با استفاده از کروماتوگرافی مایع با عملکرد فوق‌العاده طیف‌سنجی جرمی پشت سر هم (چهار قطبی سه‌گانه Agilent 6495) با منبع یونیزاسیون الکتروسپری (ESI) در حالت نظارت بر واکنش چندگانه (MRM) اندازه‌گیری شد.یک ستون ACQUITY BEH Amide (2.1 × 100 میلی متر، 1.7 میکرومتر، آب) برای جداسازی متابولیت ها استفاده شد.فاز متحرک شامل 90٪ (A) و 5٪ استونیتریل (B) با 10 میلی مول در لیتر استات آمونیوم و 0.1٪ محلول آمونیاک بود.برنامه گرادیان به شرح زیر بود: 0-1.5 دقیقه، 0٪ B.1.5-6.5 دقیقه، 0-15٪ B.6.5-8 دقیقه، 15٪ B;8-8.5 دقیقه، 15٪ - 0٪ B;8.5-11.5 دقیقه، 0٪ B.ستون در دمای 40 درجه سانتیگراد و نمونه در دمای 10 درجه سانتیگراد در نمونه برداری خودکار نگهداری شد.سرعت جریان 0.3 میلی لیتر در دقیقه و حجم تزریق 1 میکرولیتر بود.پارامترهای MS به شرح زیر تنظیم شد: ولتاژ مویرگی ± 3.5 کیلو ولت، فشار نبولایزر 35 psi، جریان گاز غلاف 12 لیتر در دقیقه، دمای گاز غلاف 350 درجه سانتی گراد، دمای گاز خشک کردن 250 درجه سانتی گراد، و جریان گاز خشک کن 14 لیتر در دقیقه.تبدیل MRM تریپتوفان، پیروات، لاکتات، هیپوگزانتین و گزانتین 205.0-187.9، 87.0-43.4، 89.0-43.3، 135.0-92.3 و 151.0-107 بود.9 به ترتیب.داده ها با استفاده از Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies) جمع آوری شد.برای نمونه‌های سرم، تریپتوفان، پیروات، لاکتات، هیپوگزانتین و گزانتین با استفاده از منحنی‌های کالیبراسیون محلول‌های مخلوط استاندارد اندازه‌گیری شدند.برای نمونه های سلولی، محتوای تریپتوفان به استاندارد داخلی و توده پروتئین سلول نرمال شد.
استخراج پیک (m/z و زمان ماند (RT)) با استفاده از Compound Discovery 3.1 و TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific) انجام شد.برای حذف تفاوت‌های بالقوه بین دسته‌ها، هر پیک مشخصه نمونه آزمایشی بر پیک مشخصه ماده مرجع از همان دسته تقسیم شد تا فراوانی نسبی به دست آید.انحرافات استاندارد نسبی استانداردهای داخلی قبل و بعد از استانداردسازی در جدول تکمیلی 6 نشان داده شده است. تفاوت بین دو گروه با نرخ کشف نادرست (FDR <0.05، آزمون رتبه علامت دار Wilcoxon) و تغییر برابری (> 1.2 یا <0.83) مشخص شد.داده‌های خام MS ویژگی‌های استخراج‌شده و داده‌های MS تصحیح‌شده با سرم مرجع، به ترتیب در داده‌های تکمیلی 1 و داده‌های تکمیلی 2 نشان داده شده‌اند.حاشیه نویسی اوج بر اساس چهار سطح تعریف شده از شناسایی، از جمله متابولیت های شناسایی شده، ترکیبات مشروح فرضی، کلاس های ترکیبی مشخص شده ظاهرا، و ترکیبات ناشناخته انجام شد 22 .بر اساس جستجوهای پایگاه داده در Compound Discovery 3.1 (mzCloud، HMDB، Chemspider)، ترکیبات بیولوژیکی با استانداردهای تایید شده MS/MS یا حاشیه نویسی تطابق دقیق در mzCloud (امتیاز > 85) یا Chemspider در نهایت به عنوان واسطه بین متابولوم دیفرانسیل انتخاب شدند.حاشیه نویسی اوج برای هر ویژگی در داده های تکمیلی 3 گنجانده شده است. MetaboAnalyst 5.0 برای تجزیه و تحلیل تک متغیره فراوانی متابولیت های نرمال شده با مجموع استفاده شد.MetaboAnalyst 5.0 همچنین تجزیه و تحلیل غنی‌سازی مسیر KEGG را بر اساس متابولیت‌های بسیار متفاوت ارزیابی کرد.تجزیه و تحلیل مؤلفه اصلی (PCA) و تجزیه و تحلیل تفکیک حداقل مربعات جزئی (PLS-DA) با استفاده از بسته نرم افزاری ropls (v.1.26.4) با نرمال سازی پشته و مقیاس خودکار تجزیه و تحلیل شد.مدل نشانگر زیستی متابولیت بهینه برای پیش‌بینی بدخیمی ندول با استفاده از رگرسیون لجستیک باینری با کمترین انقباض مطلق و اپراتور انتخاب (LASSO, R package v.4.1-3) ایجاد شد.عملکرد مدل متمایز در مجموعه‌های تشخیص و اعتبارسنجی با تخمین AUC بر اساس تجزیه و تحلیل ROC طبق بسته pROC (v.1.18.0) مشخص شد.برش احتمال بهینه بر اساس حداکثر شاخص یودن مدل (حساسیت + ویژگی - 1) به دست آمد.نمونه هایی با مقادیر کمتر یا بیشتر از آستانه به ترتیب به عنوان ندول های خوش خیم و آدنوکارسینوم ریه پیش بینی می شوند.
سلول های A549 (#CCL-185، مجموعه کشت نوع آمریکایی) در محیط F-12K حاوی 10% FBS رشد داده شدند.توالی‌های کوتاه RNA سنجاق سر (shRNA) با هدف قرار دادن SLC7A5 و یک کنترل غیرهدف‌گیر (NC) در ناقل لنتی‌ویروسی pLKO.1-puro قرار گرفتند.توالی های آنتی سنس shSLC7A5 به شرح زیر است: Sh1 (5'-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3')، Sh2 (5'-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3').آنتی بادی های SLC7A5 (#5347) و توبولین (#2148) از Cell Signaling Technology خریداری شدند.آنتی بادی های SLC7A5 و توبولین در رقت 1:1000 برای تجزیه و تحلیل وسترن بلات استفاده شد.
تست استرس گلیکولیتیک Seahorse XF سطوح اسیدی شدن خارج سلولی (ECAR) را اندازه گیری می کند.در این روش، گلوکز، الیگومایسین A و 2-DG به صورت متوالی برای آزمایش ظرفیت گلیکولیتیک سلولی که توسط ECAR اندازه‌گیری شد، تجویز شدند.
سلول های A549 ترانسفکت شده با کنترل غیر هدف (NC) و shSLC7A5 (Sh1, Sh2) یک شبه در ظروف به قطر 10 سانتی متر کاشته شدند.متابولیت های سلولی با 1 میلی لیتر متانول آبی 80 درصد سرد یخ استخراج شدند.سلول‌های موجود در محلول متانول خراشیده شدند، در یک لوله جدید جمع‌آوری شدند و در 15000 × گرم به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ شدند.800 میکرولیتر از مایع رویی را جمع آوری کرده و با استفاده از یک غلیظ کننده خلاء با سرعت بالا خشک کنید.سپس گلوله های متابولیت خشک شده برای سطوح تریپتوفان با استفاده از LC-MS/MS همانطور که در بالا توضیح داده شد، تجزیه و تحلیل شدند.سطوح NAD(H) سلولی در سلول‌های A549 (NC و shSLC7A5) با استفاده از کیت رنگ‌سنجی کمی NAD+/NADH (#K337، BioVision) طبق دستورالعمل‌های سازنده اندازه‌گیری شد.سطح پروتئین برای هر نمونه اندازه گیری شد تا میزان متابولیت ها عادی شود.
هیچ روش آماری برای تعیین اولیه حجم نمونه استفاده نشد.مطالعات متابولومیک قبلی با هدف کشف نشانگرهای زیستی 15،18 به عنوان معیارهایی برای تعیین اندازه در نظر گرفته شده‌اند و در مقایسه با این گزارش‌ها، نمونه ما کافی بود.هیچ نمونه ای از گروه مطالعه حذف نشد.نمونه های سرم به طور تصادفی به یک گروه اکتشافی (306 مورد، 74.6٪) و یک گروه اعتبارسنجی داخلی (104 مورد، 25.4٪) برای مطالعات متابولومیک غیر هدفمند اختصاص داده شدند.ما همچنین به طور تصادفی 70 مورد از هر گروه را از مجموعه اکتشاف برای مطالعات متابولومیک هدفمند انتخاب کردیم.محققان در طول جمع‌آوری و تجزیه و تحلیل داده‌های LC-MS نسبت به تخصیص گروهی کور شدند.آنالیزهای آماری داده‌های متابولومیک و آزمایش‌های سلولی در بخش‌های مربوط به نتایج، افسانه‌های شکل، و روش‌ها توضیح داده شده‌اند.کمی تریپتوفان سلولی، NADT، و فعالیت گلیکولیتیک سه بار به طور مستقل با نتایج یکسان انجام شد.
برای اطلاعات بیشتر در مورد طراحی مطالعه، چکیده گزارش نمونه کارها طبیعی مرتبط با این مقاله را ببینید.
داده های خام MS ویژگی های استخراج شده و داده های نرمال شده MS سرم مرجع به ترتیب در داده های تکمیلی 1 و داده های تکمیلی 2 نشان داده شده است.حاشیه نویسی اوج برای ویژگی های دیفرانسیل در داده های تکمیلی 3 ارائه شده است. مجموعه داده LUAD TCGA را می توان از https://portal.gdc.cancer.gov/ دانلود کرد.داده های ورودی برای رسم نمودار در داده های منبع ارائه شده است.اطلاعات منبع برای این مقاله ارائه شده است.
گروه ملی مطالعات غربالگری ریه و غیره کاهش مرگ و میر سرطان ریه با توموگرافی کامپیوتری با دوز پایین.شمال انگلستانجی. مد.365، 395-409 (2011).
Kramer، BS، Berg، KD، Aberle، DR و Prophet، غربالگری سرطان ریه PC با استفاده از CT هلیکال با دوز پایین: نتایج حاصل از مطالعه غربالگری ملی ریه (NLST).جی. مد.صفحه 18، 109–111 (2011).
دی کونینگ، اچ جی و همکاران.کاهش مرگ و میر سرطان ریه با غربالگری سی تی حجمی در یک کارآزمایی تصادفی.شمال انگلستانجی. مد.382, 503–513 (2020).