متابولومیکس با استفاده از آنالیز طیف‌سنجی جرمی با وضوح بالا از سرم بیمار، ندول‌های ریوی خوش‌خیم و بدخیم را با ویژگی بالا تشخیص می‌دهد.

تشخیص افتراقی ندول‌های ریوی شناسایی‌شده توسط توموگرافی کامپیوتری (CT) همچنان یک چالش در عمل بالینی است. در اینجا، ما متابولوم کلی ۴۸۰ نمونه سرم، شامل افراد سالم، ندول‌های خوش‌خیم ریه و آدنوکارسینوم ریه مرحله I را مشخص می‌کنیم. آدنوکارسینوم‌ها پروفایل‌های متابولومیک منحصر به فردی را نشان می‌دهند، در حالی که ندول‌های خوش‌خیم و افراد سالم شباهت زیادی در پروفایل‌های متابولومیک دارند. در گروه اکتشاف (n = 306)، مجموعه‌ای از ۲۷ متابولیت برای تمایز بین ندول‌های خوش‌خیم و بدخیم شناسایی شد. AUC مدل تشخیصی در گروه‌های اعتبارسنجی داخلی (n = 104) و اعتبارسنجی خارجی (n = 111) به ترتیب ۰.۹۱۵ و ۰.۹۴۵ بود. تجزیه و تحلیل مسیر، افزایش متابولیت‌های گلیکولیتیک مرتبط با کاهش تریپتوفان در سرم آدنوکارسینوم ریه را در مقایسه با ندول‌های خوش‌خیم و افراد سالم نشان داد و نشان داد که جذب تریپتوفان باعث افزایش گلیکولیز در سلول‌های سرطان ریه می‌شود. مطالعه ما ارزش نشانگرهای زیستی متابولیت‌های سرم را در ارزیابی خطر ندول‌های ریوی شناسایی‌شده توسط سی‌تی‌اسکن برجسته می‌کند.
تشخیص زودهنگام برای بهبود میزان بقای بیماران سرطانی بسیار مهم است. نتایج حاصل از آزمایش ملی غربالگری سرطان ریه ایالات متحده (NLST) و مطالعه نلسون اروپا نشان داده است که غربالگری با توموگرافی کامپیوتری با دوز پایین (LDCT) می‌تواند به طور قابل توجهی مرگ و میر ناشی از سرطان ریه را در گروه‌های پرخطر کاهش دهد1،2،3. از زمان استفاده گسترده از LDCT برای غربالگری سرطان ریه، میزان یافته‌های رادیوگرافی تصادفی ندول‌های ریوی بدون علامت همچنان رو به افزایش است4. ندول‌های ریوی به عنوان کدورت‌های کانونی تا قطر 3 سانتی‌متر تعریف می‌شوند5. ما در ارزیابی احتمال بدخیمی و مقابله با تعداد زیاد ندول‌های ریوی که به طور تصادفی در LDCT تشخیص داده می‌شوند، با مشکلاتی روبرو هستیم. محدودیت‌های CT می‌تواند منجر به معاینات مکرر پیگیری و نتایج مثبت کاذب شود که منجر به مداخله غیرضروری و درمان بیش از حد می‌شود6. بنابراین، نیاز به توسعه نشانگرهای زیستی قابل اعتماد و مفید برای شناسایی صحیح سرطان ریه در مراحل اولیه و تمایز اکثر ندول‌های خوش‌خیم در تشخیص اولیه 7 وجود دارد.
تجزیه و تحلیل جامع مولکولی خون (سرم، پلاسما، سلول‌های تک هسته‌ای خون محیطی)، از جمله ژنومیک، پروتئومیک یا متیلاسیون DNA8،9،10، منجر به افزایش علاقه به کشف نشانگرهای زیستی تشخیصی برای سرطان ریه شده است. در همین حال، رویکردهای متابولومیک، محصولات نهایی سلولی را که تحت تأثیر اقدامات درون‌زا و برون‌زا قرار دارند، اندازه‌گیری می‌کنند و بنابراین برای پیش‌بینی شروع و نتیجه بیماری به کار می‌روند. کروماتوگرافی مایع-طیف‌سنجی جرمی پشت سر هم (LC-MS) به دلیل حساسیت بالا و دامنه دینامیکی وسیع، روشی است که به طور گسترده برای مطالعات متابولومیک استفاده می‌شود، که می‌تواند متابولیت‌هایی با خواص فیزیکوشیمیایی مختلف را پوشش دهد11،12،13. اگرچه تجزیه و تحلیل متابولومیک جهانی پلاسما/سرم برای شناسایی نشانگرهای زیستی مرتبط با تشخیص سرطان ریه14،15،16،17 و اثربخشی درمان18 استفاده شده است، طبقه‌بندی‌کننده‌های متابولیت سرم برای تمایز بین ندول‌های خوش‌خیم و بدخیم ریه هنوز مورد مطالعه زیادی قرار نگرفته‌اند. - تحقیقات گسترده.
آدنوکارسینوم و کارسینوم سلول سنگفرشی دو زیرگروه اصلی سرطان ریه سلول غیرکوچک (NSCLC) هستند. آزمایش‌های مختلف غربالگری سی‌تی‌اسکن نشان می‌دهد که آدنوکارسینوم شایع‌ترین نوع بافت‌شناسی سرطان ریه است1،19،20،21. در این مطالعه، ما از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا-طیف‌سنجی جرمی با وضوح بالا (UPLC-HRMS) برای انجام تجزیه و تحلیل متابولومیک بر روی مجموع 695 نمونه سرم، از جمله افراد سالم، ندول‌های خوش‌خیم ریوی و ≤3 سانتی‌متر تشخیص داده شده توسط سی‌تی‌اسکن استفاده کردیم. غربالگری برای آدنوکارسینوم ریه مرحله I. ما مجموعه‌ای از متابولیت‌های سرم را شناسایی کردیم که آدنوکارسینوم ریه را از ندول‌های خوش‌خیم و افراد سالم متمایز می‌کند. تجزیه و تحلیل غنی‌سازی مسیر نشان داد که متابولیسم غیرطبیعی تریپتوفان و گلوکز، تغییرات رایجی در آدنوکارسینوم ریه در مقایسه با ندول‌های خوش‌خیم و افراد سالم هستند. در نهایت، ما یک طبقه‌بندی‌کننده متابولیک سرم با ویژگی و حساسیت بالا برای تمایز بین ندول‌های ریوی بدخیم و خوش‌خیم شناسایی‌شده توسط LDCT ایجاد و اعتبارسنجی کردیم که می‌تواند به تشخیص افتراقی زودهنگام و ارزیابی ریسک کمک کند.
در مطالعه حاضر، نمونه‌های سرم منطبق با سن و جنس به صورت گذشته‌نگر از ۱۷۴ فرد سالم، ۲۹۲ بیمار مبتلا به ندول‌های خوش‌خیم ریوی و ۲۲۹ بیمار مبتلا به آدنوکارسینوم ریه مرحله I جمع‌آوری شد. ویژگی‌های جمعیت‌شناختی ۶۹۵ نفر در جدول تکمیلی ۱ نشان داده شده است.
همانطور که در شکل 1a نشان داده شده است، در مجموع 480 نمونه سرم، شامل 174 نمونه کنترل سالم (HC)، 170 نمونه ندول خوش‌خیم (BN) و 136 نمونه آدنوکارسینوم ریه مرحله I (LA)، در مرکز سرطان دانشگاه سان یات-سن جمع‌آوری شدند. گروه اکتشافی برای پروفایل متابولومیک غیرهدفمند با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا-طیف‌سنجی جرمی با وضوح بالا (UPLC-HRMS). همانطور که در شکل تکمیلی 1 نشان داده شده است، متابولیت‌های افتراقی بین LA و HC، LA و BN برای ایجاد یک مدل طبقه‌بندی و بررسی بیشتر تجزیه و تحلیل مسیر افتراقی شناسایی شدند. 104 نمونه جمع‌آوری شده توسط مرکز سرطان دانشگاه سان یات-سن و 111 نمونه جمع‌آوری شده توسط دو بیمارستان دیگر به ترتیب تحت اعتبارسنجی داخلی و خارجی قرار گرفتند.
الف) جمعیت مورد مطالعه در گروه اکتشاف که تحت آنالیز متابولومیک سرم جهانی با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا-طیف‌سنجی جرمی با وضوح بالا (UPLC-HRMS) قرار گرفتند. ب) آنالیز تفکیک حداقل مربعات جزئی (PLS-DA) از کل متابولوم ۴۸۰ نمونه سرم از گروه مورد مطالعه، شامل افراد سالم (HC، n = ۱۷۴)، ندول‌های خوش‌خیم (BN، n = ۱۷۰) و آدنوکارسینوم ریه مرحله I (لس‌آنجلس، n = ۱۳۶). +ESI، حالت یونیزاسیون الکترواسپری مثبت، -ESI، حالت یونیزاسیون الکترواسپری منفی. ج-ه) متابولیت‌هایی با فراوانی‌های متفاوت قابل توجه در دو گروه داده شده (آزمون رتبه‌بندی علامت‌دار ویلکاکسون دو طرفه، مقدار p تعدیل‌شده با نرخ کشف کاذب، FDR <0.05) با رنگ قرمز (تغییر برابر > ۱.۲) و آبی (تغییر برابر < ۰.۸۳) نشان داده شده‌اند.) که در نمودار آتشفشان نشان داده شده است. f نقشه حرارتی خوشه‌بندی سلسله مراتبی که تفاوت‌های قابل‌توجهی را در تعداد متابولیت‌های حاشیه‌نویسی‌شده بین LA و BN نشان می‌دهد. داده‌های منبع به شکل فایل‌های داده‌های منبع ارائه شده‌اند.
متابولوم کل سرم ۱۷۴ HC، ۱۷۰ BN و ۱۳۶ LA در گروه اکتشاف با استفاده از آنالیز UPLC-HRMS مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. ابتدا نشان می‌دهیم که نمونه‌های کنترل کیفیت (QC) به طور فشرده در مرکز یک مدل تحلیل مؤلفه‌های اصلی بدون نظارت (PCA) قرار می‌گیرند که پایداری عملکرد مطالعه حاضر را تأیید می‌کند (شکل تکمیلی ۲).
همانطور که در تحلیل تفکیک حداقل مربعات جزئی (PLS-DA) در شکل 1b نشان داده شده است، دریافتیم که تفاوت‌های آشکاری بین LA و BN، LA و HC در حالت‌های یونیزاسیون الکترواسپری مثبت (+ESI) و منفی (−ESI) جدا شده وجود دارد. با این حال، هیچ تفاوت معنی‌داری بین BN و HC در شرایط +ESI و -ESI یافت نشد.
ما 382 ویژگی افتراقی بین LA و HC، 231 ویژگی افتراقی بین LA و BN و 95 ویژگی افتراقی بین BN و HC (آزمون رتبه‌بندی علامت‌دار ویلکاکسون، FDR <0.05 و تغییرات چندگانه >1.2 یا <0.83) پیدا کردیم (شکل .1c-e). پیک‌ها بیشتر (داده‌های تکمیلی 3) در مقابل یک پایگاه داده (کتابخانه mzCloud/HMDB/Chemspider) با استفاده از مقدار m/z، زمان ماندگاری و جستجوی طیف جرمی قطعه قطعه شدن (جزئیات در بخش روش‌ها توضیح داده شده است) حاشیه‌نویسی شدند (داده‌های تکمیلی 3). در نهایت، 33 و 38 متابولیت حاشیه‌نویسی شده با تفاوت‌های قابل توجه در فراوانی به ترتیب برای LA در مقابل BN (شکل 1f و جدول تکمیلی 2) و LA در مقابل HC (شکل تکمیلی 3 و جدول تکمیلی 2) شناسایی شدند. در مقابل، تنها 3 متابولیت با تفاوت‌های قابل توجه در فراوانی در BN و HC شناسایی شدند (جدول تکمیلی 2)، که با همپوشانی بین BN و HC در PLS-DA مطابقت دارد. این متابولیت‌های افتراقی طیف وسیعی از مواد بیوشیمیایی را پوشش می‌دهند (شکل تکمیلی 4). در مجموع، این نتایج تغییرات قابل توجهی را در متابولوم سرم نشان می‌دهند که نشان‌دهنده تبدیل بدخیم سرطان ریه در مراحل اولیه در مقایسه با ندول‌های خوش‌خیم ریه یا افراد سالم است. در همین حال، شباهت متابولوم سرم BN و HC نشان می‌دهد که ندول‌های خوش‌خیم ریوی ممکن است ویژگی‌های بیولوژیکی بسیاری را با افراد سالم به اشتراک بگذارند. با توجه به اینکه جهش‌های ژن گیرنده فاکتور رشد اپیدرمی (EGFR) در زیرگروه 23 آدنوکارسینوم ریه رایج است، ما به دنبال تعیین تأثیر جهش‌های محرک بر متابولوم سرم بودیم. سپس مشخصات متابولومیک کلی 72 مورد با وضعیت EGFR در گروه آدنوکارسینوم ریه را تجزیه و تحلیل کردیم. جالب توجه است که ما در آنالیز PCA پروفایل‌های قابل مقایسه‌ای بین بیماران جهش‌یافته EGFR (41 نفر) و بیماران نوع وحشی EGFR (31 نفر) پیدا کردیم (شکل تکمیلی 5a). با این حال، ما 7 متابولیت را شناسایی کردیم که فراوانی آنها در بیماران دارای جهش EGFR در مقایسه با بیماران دارای نوع وحشی EGFR به طور قابل توجهی تغییر کرده بود (آزمون t، p < 0.05 و fold change > 1.2 یا < 0.83) (شکل تکمیلی 5b). اکثر این متابولیت‌ها (5 از 7) آسیل‌کارنیتین‌ها هستند که نقش مهمی در مسیرهای اکسیداسیون اسیدهای چرب دارند.
همانطور که در گردش کار نشان داده شده در شکل 2 الف نشان داده شده است، نشانگرهای زیستی برای طبقه‌بندی گره‌ها با استفاده از عملگرهای انقباض مطلق حداقل و انتخاب بر اساس 33 متابولیت افتراقی شناسایی شده در LA (n = 136) و BN (n = 170) به دست آمدند. بهترین ترکیب متغیرها (LASSO) - مدل رگرسیون لجستیک دوتایی. برای آزمایش قابلیت اطمینان مدل، از اعتبارسنجی متقابل ده‌گانه استفاده شد. انتخاب متغیر و منظم‌سازی پارامتر با یک جریمه حداکثرسازی درستنمایی با پارامتر λ24 تنظیم می‌شوند. تجزیه و تحلیل متابولومیک جهانی به طور مستقل در گروه‌های اعتبارسنجی داخلی (n = 104) و اعتبارسنجی خارجی (n = 111) برای آزمایش عملکرد طبقه‌بندی مدل تشخیصی انجام شد. در نتیجه، 27 متابولیت در مجموعه کشف به عنوان بهترین مدل تشخیصی با بزرگترین مقدار میانگین AUC شناسایی شدند (شکل 2 ب)، که از این میان 9 مورد فعالیت افزایش یافته و 18 مورد فعالیت کاهش یافته در LA در مقایسه با BN داشتند (شکل 2 ج).
گردش کار برای ساخت یک طبقه‌بندی‌کننده ندول ریوی، شامل انتخاب بهترین پنل متابولیت‌های سرم در مجموعه کشف با استفاده از یک مدل رگرسیون لجستیک دودویی از طریق اعتبارسنجی متقابل ده‌گانه و ارزیابی عملکرد پیش‌بینی‌کننده در مجموعه‌های اعتبارسنجی داخلی و خارجی. ب آمار اعتبارسنجی متقابل مدل رگرسیون LASSO برای انتخاب نشانگر زیستی متابولیک. اعداد داده شده در بالا نشان دهنده میانگین تعداد نشانگرهای زیستی انتخاب شده در یک λ مشخص است. خط نقطه‌چین قرمز نشان دهنده میانگین مقدار AUC در لامبدا مربوطه است. میله‌های خطای خاکستری نشان دهنده حداقل و حداکثر مقادیر AUC هستند. خط نقطه‌چین بهترین مدل را با 27 نشانگر زیستی انتخاب شده نشان می‌دهد. AUC، مساحت زیر منحنی مشخصه عملکرد گیرنده (ROC). ج تغییرات برابر 27 متابولیت انتخاب شده در گروه LA در مقایسه با گروه BN در گروه کشف. ستون قرمز - فعال‌سازی. ستون آبی کاهش است. d-f منحنی‌های مشخصه عملکرد گیرنده (ROC) که قدرت مدل تشخیصی را بر اساس 27 ترکیب متابولیت در مجموعه‌های کشف، اعتبارسنجی داخلی و خارجی نشان می‌دهند. داده‌های منبع در قالب فایل‌های داده منبع ارائه می‌شوند.
یک مدل پیش‌بینی بر اساس ضرایب رگرسیون وزنی این 27 متابولیت ایجاد شد (جدول تکمیلی 3). تجزیه و تحلیل ROC بر اساس این 27 متابولیت، مقدار مساحت زیر منحنی (AUC) 0.933، حساسیت گروه اکتشاف 0.868 و ویژگی 0.859 را نشان داد (شکل 2d). در همین حال، در میان 38 متابولیت افتراقی حاشیه‌نویسی شده بین LA و HC، مجموعه‌ای از 16 متابولیت، AUC برابر با 0.902 با حساسیت 0.801 و ویژگی 0.856 را در تمایز LA از HC به دست آوردند (شکل تکمیلی 6a-c). مقادیر AUC بر اساس آستانه‌های مختلف تغییر فولد برای متابولیت‌های افتراقی نیز مقایسه شدند. ما دریافتیم که مدل طبقه‌بندی در تمایز بین LA و BN (HC) زمانی که سطح تغییر فولد روی 1.2 در مقابل 1.5 یا 2.0 تنظیم شده بود، بهترین عملکرد را داشت (شکل تکمیلی 7a،b). مدل طبقه‌بندی، بر اساس 27 گروه متابولیت، در گروه‌های داخلی و خارجی بیشتر اعتبارسنجی شد. سطح زیر منحنی (AUC) برای اعتبارسنجی داخلی 0.915 (حساسیت 0.867، ویژگی 0.811) و برای اعتبارسنجی خارجی 0.945 (حساسیت 0.810، ویژگی 0.979) بود (شکل 2e، f). برای ارزیابی کارایی بین آزمایشگاهی، 40 نمونه از گروه خارجی در یک آزمایشگاه خارجی همانطور که در بخش روش‌ها توضیح داده شده است، مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. دقت طبقه‌بندی به سطح زیر منحنی 0.925 رسید (شکل تکمیلی 8). از آنجا که کارسینوم سلول سنگفرشی ریه (LUSC) دومین زیرگروه شایع سرطان ریه سلول غیرکوچک (NSCLC) پس از آدنوکارسینوم ریه (LUAD) است، ما همچنین سودمندی بالقوه اعتبارسنجی شده پروفایل‌های متابولیک را آزمایش کردیم. BN و 16 مورد LUSC. AUC برای تمایز بین LUSC و BN برابر با 0.776 بود (شکل تکمیلی 9)، که نشان دهنده توانایی ضعیف‌تر در مقایسه با تمایز بین LUAD و BN است.
مطالعات نشان داده‌اند که اندازه ندول‌ها در تصاویر سی‌تی‌اسکن با احتمال بدخیمی همبستگی مثبت دارد و همچنان یک عامل تعیین‌کننده اصلی درمان ندول است25،26،27. تجزیه و تحلیل داده‌های گروه بزرگ مطالعه غربالگری نلسون نشان داد که خطر بدخیمی در افراد دارای گره‌های کمتر از 5 میلی‌متر حتی مشابه افراد بدون گره است28. بنابراین، حداقل اندازه‌ای که نیاز به نظارت منظم سی‌تی‌اسکن دارد، 5 میلی‌متر است، همانطور که توسط انجمن قفسه سینه بریتانیا (BTS) توصیه شده است، و 6 میلی‌متر است، همانطور که توسط انجمن فلایشنر 29 توصیه شده است. با این حال، ندول‌های بزرگتر از 6 میلی‌متر و بدون ویژگی‌های خوش‌خیم آشکار، که ندول‌های ریوی نامشخص (IPN) نامیده می‌شوند، همچنان یک چالش بزرگ در ارزیابی و مدیریت در عمل بالینی هستند30،31. در ادامه بررسی کردیم که آیا اندازه ندول بر امضاهای متابولومیک با استفاده از نمونه‌های جمع‌آوری‌شده از گروه‌های اکتشاف و اعتبارسنجی داخلی تأثیر می‌گذارد یا خیر. با تمرکز بر 27 نشانگر زیستی معتبر، ابتدا پروفایل‌های PCA متابولوم‌های زیر 6 میلی‌متر HC و BN را مقایسه کردیم. دریافتیم که بیشتر نقاط داده برای HC و BN همپوشانی دارند و نشان می‌دهند که سطح متابولیت‌های سرم در هر دو گروه مشابه است (شکل 3a). نقشه‌های ویژگی در محدوده‌های اندازه مختلف در BN و LA حفظ شده‌اند (شکل 3b، c)، در حالی که بین ندول‌های بدخیم و خوش‌خیم در محدوده 6 تا 20 میلی‌متر جدایی مشاهده شد (شکل 3d). این گروه دارای AUC برابر با 0.927، ویژگی 0.868 و حساسیت 0.820 برای پیش‌بینی بدخیمی ندول‌های با اندازه 6 تا 20 میلی‌متر بود (شکل 3e، f). نتایج ما نشان می‌دهد که طبقه‌بندی‌کننده می‌تواند تغییرات متابولیکی ناشی از تبدیل بدخیم اولیه را صرف نظر از اندازه ندول ثبت کند.
مقایسه پروفایل‌های PCA بین گروه‌های مشخص‌شده بر اساس طبقه‌بندی‌کننده متابولیکی ۲۷ متابولیت. CC و BN < 6 میلی‌متر. b BN < 6 میلی‌متر در مقابل BN 6-20 میلی‌متر. در LA 6-20 میلی‌متر در مقابل LA 20-30 میلی‌متر. g BN 6-20 میلی‌متر و LA 6-20 میلی‌متر. GC، n = 174؛ BN < 6 میلی‌متر، n = 153؛ BN 6-20 میلی‌متر، n = 91؛ LA 6-20 میلی‌متر، n = 89؛ LA 20-30 میلی‌متر، n = 77. e منحنی مشخصه عملکرد گیرنده (ROC) که عملکرد مدل تفکیک‌کننده را برای گره‌های ۶-۲۰ میلی‌متر نشان می‌دهد. f مقادیر احتمال بر اساس مدل رگرسیون لجستیک برای گره‌های با اندازه ۶-۲۰ میلی‌متر محاسبه شدند. خط نقطه‌چین خاکستری نشان دهنده مقدار حد آستانه بهینه (0.455) است. اعداد بالا نشان دهنده درصد موارد پیش‌بینی شده برای لس‌آنجلس هستند. از آزمون t استیودنت دو طرفه استفاده کنید. PCA، تحلیل مؤلفه‌های اصلی. مساحت AUC زیر منحنی. داده‌های منبع به صورت فایل‌های داده‌های منبع ارائه شده‌اند.
چهار نمونه (با سن 44 تا 61 سال) با اندازه‌های مشابه گره ریوی (7 تا 9 میلی‌متر) برای نشان دادن عملکرد مدل پیش‌بینی بدخیمی پیشنهادی انتخاب شدند (شکل 4a، b). در غربالگری اولیه، مورد 1 به عنوان یک گره جامد با کلسیفیکاسیون، یک ویژگی مرتبط با خوش‌خیمی، ارائه شد، در حالی که مورد 2 به عنوان یک گره نیمه جامد نامشخص بدون هیچ ویژگی خوش‌خیم آشکاری ارائه شد. سه دور سی‌تی‌اسکن پیگیری نشان داد که این موارد در یک دوره 4 ساله پایدار باقی مانده‌اند و بنابراین به عنوان گره‌های خوش‌خیم در نظر گرفته می‌شوند (شکل 4a). در مقایسه با ارزیابی بالینی سی‌تی‌اسکن‌های سریالی، تجزیه و تحلیل متابولیت‌های سرم تک‌شات با مدل طبقه‌بندی فعلی، این گره‌های خوش‌خیم را بر اساس محدودیت‌های احتمالی به سرعت و به درستی شناسایی کرد (جدول 1). شکل 4b در مورد 3، گره‌ای را با علائم انقباض پلور نشان می‌دهد که اغلب با بدخیمی مرتبط است32. مورد 4 به عنوان یک گره نیمه جامد نامشخص بدون هیچ مدرکی از علت خوش‌خیم ارائه شد. طبق مدل طبقه‌بندی، همه این موارد بدخیم پیش‌بینی شدند (جدول 1). ارزیابی آدنوکارسینوم ریه با بررسی هیستوپاتولوژیک پس از جراحی برداشتن ریه نشان داده شد (شکل 4b). برای مجموعه اعتبارسنجی خارجی، طبقه‌بندی‌کننده متابولیک دو مورد از ندول‌های ریوی نامشخص بزرگتر از 6 میلی‌متر را به طور دقیق پیش‌بینی کرد (شکل تکمیلی 10).
تصاویر سی‌تی‌اسکن از پنجره محوری ریه‌های دو مورد ندول خوش‌خیم. در مورد ۱، سی‌تی‌اسکن پس از ۴ سال، یک ندول جامد پایدار به اندازه ۷ میلی‌متر با کلسیفیکاسیون در لوب تحتانی راست را نشان داد. در مورد ۲، سی‌تی‌اسکن پس از ۵ سال، یک ندول پایدار و تا حدی جامد با قطر ۷ میلی‌متر در لوب فوقانی راست را نشان داد. ب. تصاویر سی‌تی‌اسکن از پنجره محوری ریه‌ها و مطالعات پاتولوژیک مربوطه از دو مورد آدنوکارسینوم مرحله I قبل از برداشتن ریه. مورد ۳، یک ندول با قطر ۸ میلی‌متر در لوب فوقانی راست با انقباض پلور را نشان داد. مورد ۴، یک ندول شیشه‌ای مات تا حدی جامد به اندازه ۹ میلی‌متر در لوب فوقانی چپ را نشان داد. رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) از بافت ریه برداشته شده (خط مقیاس = ۵۰ میکرومتر) الگوی رشد آسینار آدنوکارسینوم ریه را نشان می‌دهد. فلش‌ها نشان دهنده ندول‌های شناسایی شده در تصاویر سی‌تی‌اسکن هستند. تصاویر H&E تصاویر نمایشی از چندین (بیش از ۳) میدان میکروسکوپی هستند که توسط پاتولوژیست بررسی شده‌اند.
روی هم رفته، نتایج ما ارزش بالقوه نشانگرهای زیستی متابولیت سرم را در تشخیص افتراقی ندول‌های ریوی نشان می‌دهد، که ممکن است هنگام ارزیابی غربالگری سی‌تی‌اسکن چالش‌هایی را ایجاد کند.
بر اساس یک پنل متابولیت افتراقی معتبر، ما به دنبال شناسایی هم‌بسته‌های بیولوژیکی تغییرات عمده متابولیکی بودیم. تجزیه و تحلیل غنی‌سازی مسیر KEGG توسط MetaboAnalyst، 6 مسیر مشترک با تغییرات قابل توجه بین دو گروه مشخص را شناسایی کرد (LA در مقابل HC و LA در مقابل BN، p تنظیم‌شده ≤ 0.001، اثر > 0.01). این تغییرات با اختلالاتی در متابولیسم پیروات، متابولیسم تریپتوفان، متابولیسم نیاسین و نیکوتین‌آمید، گلیکولیز، چرخه TCA و متابولیسم پورین مشخص شدند (شکل 5a). سپس متابولومیکس هدفمند بیشتری را برای تأیید تغییرات عمده با استفاده از کمی‌سازی مطلق انجام دادیم. تعیین متابولیت‌های مشترک در مسیرهای مشترک تغییر یافته توسط طیف‌سنجی جرمی چهارقطبی سه‌گانه (QQQ) با استفاده از استانداردهای معتبر متابولیت. ویژگی‌های جمعیت‌شناختی نمونه هدف مطالعه متابولومیکس در جدول تکمیلی 4 آمده است. مطابق با نتایج متابولومیکس جهانی ما، تجزیه و تحلیل کمی تأیید کرد که هیپوگزانتین و گزانتین، پیروات و لاکتات در LA در مقایسه با BN و HC افزایش یافته است (شکل 5b، c، p <0.05). با این حال، هیچ تفاوت معنی‌داری در این متابولیت‌ها بین BN و HC مشاهده نشد.
تجزیه و تحلیل غنی‌سازی مسیر KEGG از متابولیت‌های با تفاوت معنی‌دار در گروه LA در مقایسه با گروه‌های BN و HC. از یک آزمون جهانی دوطرفه استفاده شد و مقادیر p با استفاده از روش Holm-Bonferroni (p تعدیل‌شده ≤ 0.001 و اندازه اثر > 0.01) تنظیم شدند. b-d نمودارهای ویولن نشان دهنده سطوح هیپوگزانتین، گزانتین، لاکتات، پیروات و تریپتوفان در سرم HC، BN و LA تعیین شده توسط LC-MS/MS (n = 70 در هر گروه) هستند. خطوط نقطه‌چین سفید و سیاه به ترتیب میانه و چارک را نشان می‌دهند. e نمودار ویولن نشان دهنده بیان نرمال شده Log2TPM (رونوشت در میلیون) mRNA مربوط به SLC7A5 و QPRT در آدنوکارسینوم ریه (n = 513) در مقایسه با بافت ریه طبیعی (n = 59) در مجموعه داده LUAD-TCGA است. کادر سفید نشان‌دهنده‌ی محدوده‌ی بین چارکی، خط سیاه افقی در مرکز نشان‌دهنده‌ی میانه و خط سیاه عمودی که از کادر امتداد می‌یابد نشان‌دهنده‌ی فاصله‌ی اطمینان 95% (CI) است. f نمودار همبستگی پیرسون بیان SLC7A5 و GAPDH در آدنوکارسینوم ریه (n = 513) و بافت ریه‌ی طبیعی (n = 59) در مجموعه‌ی داده‌ی TCGA. ناحیه‌ی خاکستری نشان‌دهنده‌ی فاصله‌ی اطمینان 95% است. r، ضریب همبستگی پیرسون. g سطح تریپتوفان سلولی نرمال‌شده در سلول‌های A549 ترانسفکت‌شده با کنترل shRNA غیراختصاصی (NC) و shSLC7A5 (Sh1، Sh2) که توسط LC-MS/MS تعیین شده است. تجزیه و تحلیل آماری پنج نمونه‌ی مستقل بیولوژیکی در هر گروه ارائه شده است. h سطح سلولی NADt (NAD کل، شامل NAD+ و NADH) در سلول‌های A549 (NC) و سلول‌های A549 دارای SLC7A5 مهار شده (Sh1، Sh2). تجزیه و تحلیل آماری سه نمونه‌ی مستقل بیولوژیکی در هر گروه ارائه شده است. فعالیت گلیکولیتیک سلول‌های A549 قبل و بعد از مهار SLC7A5 با استفاده از نرخ اسیدی شدن خارج سلولی (ECAR) اندازه‌گیری شد (n = 4 نمونه بیولوژیکی مستقل در هر گروه). 2-DG، 2-دئوکسی-D-گلوکز. آزمون t دو طرفه در (b-h) استفاده شد. در (g-i)، میله‌های خطا نشان دهنده میانگین ± انحراف معیار هستند، هر آزمایش سه بار به طور مستقل انجام شد و نتایج مشابه بودند. داده‌های منبع به صورت فایل‌های داده‌های منبع ارائه شده‌اند.
با توجه به تأثیر قابل توجه متابولیسم تغییر یافته تریپتوفان در گروه LA، ما همچنین سطح تریپتوفان سرم را در گروه‌های HC، BN و LA با استفاده از QQQ ارزیابی کردیم. ما دریافتیم که تریپتوفان سرم در LA در مقایسه با HC یا BN کاهش یافته است (p < 0.001، شکل 5d)، که با یافته‌های قبلی مبنی بر اینکه سطح تریپتوفان در گردش خون در بیماران مبتلا به سرطان ریه کمتر از افراد سالم از گروه کنترل است، مطابقت دارد.33،34،35. مطالعه دیگری با استفاده از ردیاب PET/CT 11C-methyl-L-tryptophan نشان داد که زمان ماندگاری سیگنال تریپتوفان در بافت سرطان ریه در مقایسه با ضایعات خوش‌خیم یا بافت طبیعی به طور قابل توجهی افزایش یافته است.36 ما فرض می‌کنیم که کاهش تریپتوفان در سرم LA ممکن است نشان‌دهنده جذب فعال تریپتوفان توسط سلول‌های سرطان ریه باشد.
همچنین مشخص است که محصول نهایی مسیر کینورنین کاتابولیسم تریپتوفان، NAD+37,38 است که یک سوبسترای مهم برای واکنش گلیسرآلدئید-3-فسفات با 1،3-بیس فسفوگلیسرات در گلیکولیز است39. در حالی که مطالعات قبلی بر نقش کاتابولیسم تریپتوفان در تنظیم ایمنی متمرکز بوده‌اند، ما در مطالعه حاضر به دنبال روشن کردن تعامل بین اختلال تنظیم تریپتوفان و مسیرهای گلیکولیتیک مشاهده شده بودیم. 5 عضو خانواده 7 ناقل املاح (SLC7A5) به عنوان یک ناقل تریپتوفان شناخته می‌شود43،44،45. فسفوریبوزیل ترانسفراز اسید کینولینیک (QPRT) آنزیمی است که در پایین دست مسیر کینورنین قرار دارد و اسید کینولینیک را به NAMN46 تبدیل می‌کند. بررسی مجموعه داده‌های LUAD TCGA نشان داد که هم SLC7A5 و هم QPRT در بافت تومور در مقایسه با بافت طبیعی به طور قابل توجهی افزایش بیان داشته‌اند (شکل 5e). این افزایش در مراحل I و II و همچنین مراحل III و IV آدنوکارسینوم ریه مشاهده شد (شکل تکمیلی 11)، که نشان دهنده اختلالات اولیه در متابولیسم تریپتوفان مرتبط با تومورزایی است.
علاوه بر این، مجموعه داده‌های LUAD-TCGA همبستگی مثبتی بین بیان mRNAی SLC7A5 و GAPDH در نمونه‌های بیماران سرطانی نشان داد (r = 0.45، p = 1.55E-26، شکل 5f). در مقابل، هیچ همبستگی معنی‌داری بین چنین امضاهای ژنی در بافت ریه طبیعی یافت نشد (r = 0.25، p = 0.06، شکل 5f). مهار SLC7A5 (شکل تکمیلی 12) در سلول‌های A549 به طور قابل توجهی سطح تریپتوفان سلولی و NAD(H) را کاهش داد (شکل 5g، h)، که منجر به کاهش فعالیت گلیکولیتیک شد که با نرخ اسیدی شدن خارج سلولی (ECAR) اندازه‌گیری می‌شود (شکل 1). 5i). بنابراین، بر اساس تغییرات متابولیکی در سرم و تشخیص آزمایشگاهی، ما فرض می‌کنیم که متابولیسم تریپتوفان ممکن است NAD+ را از طریق مسیر کینورنین تولید کند و نقش مهمی در پیشبرد گلیکولیز در سرطان ریه داشته باشد.
مطالعات نشان داده‌اند که تعداد زیادی از ندول‌های ریوی نامشخص که توسط LDCT تشخیص داده می‌شوند، ممکن است به دلیل تشخیص مثبت کاذب بدخیمی، نیاز به آزمایش‌های اضافی مانند PET-CT، بیوپسی ریه و درمان بیش از حد داشته باشند.31 همانطور که در شکل 6 نشان داده شده است، مطالعه ما مجموعه‌ای از متابولیت‌های سرم را با ارزش تشخیصی بالقوه شناسایی کرد که ممکن است طبقه‌بندی خطر و مدیریت بعدی ندول‌های ریوی تشخیص داده شده توسط CT را بهبود بخشد.
ندول‌های ریوی با استفاده از توموگرافی کامپیوتری با دوز پایین (LDCT) با ویژگی‌های تصویربرداری که نشان‌دهنده علل خوش‌خیم یا بدخیم هستند، ارزیابی می‌شوند. نتیجه نامشخص ندول‌ها می‌تواند منجر به ویزیت‌های مکرر پیگیری، مداخلات غیرضروری و درمان بیش از حد شود. گنجاندن طبقه‌بندی‌کننده‌های متابولیک سرم با ارزش تشخیصی ممکن است ارزیابی ریسک و مدیریت بعدی ندول‌های ریوی را بهبود بخشد. توموگرافی گسیل پوزیترون PET.
داده‌های مطالعه NLST ایالات متحده و مطالعه NELSON اروپا نشان می‌دهد که غربالگری گروه‌های پرخطر با توموگرافی کامپیوتری با دوز پایین (LDCT) ممکن است مرگ و میر ناشی از سرطان ریه را کاهش دهد1،3. با این حال، ارزیابی ریسک و مدیریت بالینی متعاقب تعداد زیادی از ندول‌های ریوی تصادفی که توسط LDCT شناسایی شده‌اند، همچنان چالش برانگیزترین است. هدف اصلی، بهینه‌سازی طبقه‌بندی صحیح پروتکل‌های مبتنی بر LDCT موجود با گنجاندن نشانگرهای زیستی قابل اعتماد است.
نشانگرهای زیستی مولکولی خاصی، مانند متابولیت‌های خون، با مقایسه سرطان ریه با افراد سالم شناسایی شده‌اند15،17. در مطالعه حاضر، ما بر کاربرد آنالیز متابولومیکس سرم برای تمایز بین ندول‌های ریوی خوش‌خیم و بدخیم که به طور تصادفی توسط LDCT تشخیص داده شده‌اند، تمرکز کردیم. ما متابولوم سرم کلی نمونه‌های کنترل سالم (HC)، ندول‌های خوش‌خیم ریه (BN) و آدنوکارسینوم ریه مرحله I (LA) را با استفاده از آنالیز UPLC-HRMS مقایسه کردیم. ما دریافتیم که HC و BN پروفایل‌های متابولیکی مشابهی دارند، در حالی که LA در مقایسه با HC و BN تغییرات قابل توجهی نشان داد. ما دو مجموعه از متابولیت‌های سرم را شناسایی کردیم که LA را از HC و BN متمایز می‌کند.
طرح شناسایی فعلی مبتنی بر LDCT برای ندول‌های خوش‌خیم و بدخیم عمدتاً بر اساس اندازه، تراکم، مورفولوژی و سرعت رشد ندول‌ها در طول زمان است30. مطالعات قبلی نشان داده‌اند که اندازه ندول‌ها ارتباط نزدیکی با احتمال سرطان ریه دارد. حتی در بیماران پرخطر، خطر بدخیمی در گره‌های کمتر از 6 میلی‌متر کمتر از 1٪ است. خطر بدخیمی برای ندول‌های با اندازه 6 تا 20 میلی‌متر از 8٪ تا 64٪ متغیر است30. بنابراین، انجمن فلایشنر قطر حد آستانه 6 میلی‌متر را برای پیگیری روتین سی‌تی‌اسکن توصیه می‌کند.29 با این حال، ارزیابی خطر و مدیریت ندول‌های ریوی نامشخص (IPN) بزرگتر از 6 میلی‌متر به طور کافی انجام نشده است31. مدیریت فعلی بیماری‌های مادرزادی قلب معمولاً مبتنی بر انتظار هوشیارانه با نظارت مکرر سی‌تی‌اسکن است.
بر اساس متابولوم اعتبارسنجی‌شده، ما برای اولین بار همپوشانی امضاهای متابولومیک بین افراد سالم و ندول‌های خوش‌خیم <6 میلی‌متر را نشان دادیم. شباهت بیولوژیکی با یافته‌های قبلی سی‌تی‌اسکن مطابقت دارد که نشان می‌دهد خطر بدخیمی برای ندول‌های <6 میلی‌متر به اندازه افراد بدون گره کم است.30 لازم به ذکر است که نتایج ما همچنین نشان می‌دهد که ندول‌های خوش‌خیم <6 میلی‌متر و ≥6 میلی‌متر شباهت زیادی در پروفایل‌های متابولومیک دارند، که نشان می‌دهد تعریف عملکردی علت خوش‌خیم صرف نظر از اندازه ندول ثابت است. بنابراین، پانل‌های متابولیت سرم تشخیصی مدرن ممکن است یک آزمایش واحد را به عنوان یک آزمایش رد کننده ارائه دهند، زمانی که ندول‌ها در ابتدا در سی‌تی‌اسکن تشخیص داده می‌شوند و به طور بالقوه نظارت سریالی را کاهش می‌دهند. در عین حال، همان پانل از نشانگرهای زیستی متابولیک، ندول‌های بدخیم با اندازه ≥6 میلی‌متر را از ندول‌های خوش‌خیم متمایز کرد و پیش‌بینی‌های دقیقی برای IPNهای با اندازه مشابه و ویژگی‌های مورفولوژیکی مبهم در تصاویر سی‌تی‌اسکن ارائه داد. این طبقه‌بندی‌کننده متابولیسم سرم در پیش‌بینی بدخیمی ندول‌های ≥6 میلی‌متری با AUC برابر با 0.927 عملکرد خوبی داشت. در مجموع، نتایج ما نشان می‌دهد که امضاهای متابولومیک منحصر به فرد سرم ممکن است به طور خاص تغییرات متابولیکی اولیه ناشی از تومور را منعکس کنند و ارزش بالقوه‌ای به عنوان پیش‌بینی‌کننده‌های خطر، مستقل از اندازه ندول، داشته باشند.
قابل ذکر است که آدنوکارسینوم ریه (LUAD) و کارسینوم سلول سنگفرشی (LUSC) انواع اصلی سرطان ریه سلول غیرکوچک (NSCLC) هستند. با توجه به اینکه LUSC به شدت با مصرف دخانیات مرتبط است47 و LUAD شایع‌ترین بافت‌شناسی ندول‌های تصادفی ریه است که در غربالگری سی‌تی‌اسکن شناسایی می‌شوند48، مدل طبقه‌بندی ما به طور خاص برای نمونه‌های آدنوکارسینوم مرحله I ساخته شده است. وانگ و همکارانش همچنین بر LUAD تمرکز کردند و با استفاده از لیپیدومیکس، نه امضای لیپیدی را برای تمایز سرطان ریه در مراحل اولیه از افراد سالم شناسایی کردند17. ما مدل طبقه‌بندی فعلی را روی 16 مورد LUSC مرحله I و 74 ندول خوش‌خیم آزمایش کردیم و دقت پیش‌بینی LUSC پایینی (AUC 0.776) مشاهده کردیم، که نشان می‌دهد LUAD و LUSC ممکن است امضاهای متابولومیکی خاص خود را داشته باشند. در واقع، نشان داده شده است که LUAD و LUSC در علت‌شناسی، منشأ بیولوژیکی و ناهنجاری‌های ژنتیکی متفاوت هستند49. بنابراین، انواع دیگر بافت‌شناسی باید در مدل‌های آموزشی برای تشخیص مبتنی بر جمعیت سرطان ریه در برنامه‌های غربالگری گنجانده شوند.
در اینجا، ما شش مسیر تغییر یافته‌ی شایع در آدنوکارسینوم ریه را در مقایسه با افراد سالم و ندول‌های خوش‌خیم شناسایی کردیم. گزانتین و هیپوگزانتین متابولیت‌های رایج مسیر متابولیک پورین هستند. مطابق با نتایج ما، واسطه‌های مرتبط با متابولیسم پورین در سرم یا بافت‌های بیماران مبتلا به آدنوکارسینوم ریه در مقایسه با افراد سالم یا بیماران در مرحله پیش تهاجمی به طور قابل توجهی افزایش یافته بودند15،50. افزایش سطح گزانتین و هیپوگزانتین سرم ممکن است منعکس کننده‌ی آنابولیسم مورد نیاز برای تکثیر سریع سلول‌های سرطانی باشد. اختلال در تنظیم متابولیسم گلوکز یک مشخصه شناخته شده از متابولیسم سرطان است51. در اینجا، ما افزایش قابل توجهی در پیروات و لاکتات در گروه LA در مقایسه با گروه HC و BN مشاهده کردیم که با گزارش‌های قبلی از ناهنجاری‌های مسیر گلیکولیتیک در پروفایل‌های متابولوم سرم بیماران سرطان ریه سلول غیرکوچک (NSCLC) و افراد سالم سازگار است. نتایج سازگار هستند52،53.
نکته مهم این است که ما یک همبستگی معکوس بین متابولیسم پیروات و تریپتوفان در سرم آدنوکارسینوم‌های ریه مشاهده کردیم. سطح تریپتوفان سرم در گروه LA در مقایسه با گروه HC یا BN کاهش یافته بود. جالب توجه است که یک مطالعه در مقیاس بزرگ قبلی با استفاده از یک گروه آینده‌نگر نشان داد که سطح پایین تریپتوفان در گردش خون با افزایش خطر ابتلا به سرطان ریه مرتبط است54. تریپتوفان یک اسید آمینه ضروری است که ما کاملاً از غذا دریافت می‌کنیم. ما نتیجه می‌گیریم که کاهش تریپتوفان سرم در آدنوکارسینوم ریه ممکن است نشان‌دهنده کاهش سریع این متابولیت باشد. به خوبی شناخته شده است که محصول نهایی کاتابولیسم تریپتوفان از طریق مسیر کینورنین منبع سنتز de novo NAD+ است. از آنجا که NAD+ در درجه اول از طریق مسیر نجات تولید می‌شود، اهمیت NAD+ در متابولیسم تریپتوفان در سلامت و بیماری هنوز مشخص نشده است46. تجزیه و تحلیل ما از پایگاه داده TCGA نشان داد که بیان ناقل حل شونده تریپتوفان 7A5 (SLC7A5) در آدنوکارسینوم ریه در مقایسه با گروه کنترل طبیعی به طور قابل توجهی افزایش یافته و با بیان آنزیم گلیکولیتیک GAPDH همبستگی مثبت دارد. مطالعات قبلی عمدتاً بر نقش کاتابولیسم تریپتوفان در سرکوب پاسخ ایمنی ضد تومور40،41،42 متمرکز بوده‌اند. در اینجا نشان می‌دهیم که مهار جذب تریپتوفان با مهار SLC7A5 در سلول‌های سرطان ریه منجر به کاهش بعدی سطح NAD سلولی و تضعیف همزمان فعالیت گلیکولیتیک می‌شود. به طور خلاصه، مطالعه ما مبنای بیولوژیکی برای تغییرات در متابولیسم سرم مرتبط با تبدیل بدخیم آدنوکارسینوم ریه ارائه می‌دهد.
جهش‌های EGFR شایع‌ترین جهش‌های محرک در بیماران مبتلا به NSCLC هستند. در مطالعه ما، دریافتیم که بیماران مبتلا به جهش EGFR (n = 41) پروفایل‌های متابولومیک کلی مشابه بیماران مبتلا به EGFR نوع وحشی (n = 31) داشتند، اگرچه در بیماران مبتلا به آسیل‌کارنیتین، کاهش سطح سرمی برخی از بیماران جهش‌یافته EGFR را مشاهده کردیم. عملکرد شناخته‌شده آسیل‌کارنیتین‌ها انتقال گروه‌های آسیل از سیتوپلاسم به ماتریکس میتوکندری است که منجر به اکسیداسیون اسیدهای چرب برای تولید انرژی می‌شود. 55. مطابق با یافته‌های ما، یک مطالعه اخیر نیز با تجزیه و تحلیل متابولوم کلی 102 نمونه بافت آدنوکارسینوم ریه، پروفایل‌های متابولوم مشابهی را بین تومورهای جهش‌یافته EGFR و تومورهای نوع وحشی EGFR شناسایی کرد. جالب توجه است که محتوای آسیل‌کارنیتین در گروه جهش‌یافته EGFR نیز یافت شد. بنابراین، اینکه آیا تغییرات در سطح آسیل‌کارنیتین منعکس‌کننده تغییرات متابولیکی ناشی از EGFR است و مسیرهای مولکولی زمینه‌ای آن ممکن است نیاز به مطالعه بیشتر داشته باشد.
در نتیجه، مطالعه ما یک طبقه‌بندی کننده متابولیک سرم برای تشخیص افتراقی ندول‌های ریوی ایجاد می‌کند و یک گردش کار را پیشنهاد می‌دهد که می‌تواند ارزیابی ریسک را بهینه کرده و مدیریت بالینی را بر اساس غربالگری سی‌تی‌اسکن تسهیل کند.
این مطالعه توسط کمیته اخلاق بیمارستان سرطان دانشگاه سان یات سن، بیمارستان وابسته اول دانشگاه سان یات سن و کمیته اخلاق بیمارستان سرطان دانشگاه ژنگژو تأیید شد. در گروه‌های کشف و اعتبارسنجی داخلی، ۱۷۴ سرم از افراد سالم و ۲۴۴ سرم از ندول‌های خوش‌خیم از افرادی که تحت معاینات پزشکی سالانه در بخش کنترل و پیشگیری از سرطان، مرکز سرطان دانشگاه سان یات سن قرار می‌گرفتند و ۱۶۶ سرم از ندول‌های خوش‌خیم جمع‌آوری شد. سرم. آدنوکارسینوم ریه مرحله اول از مرکز سرطان دانشگاه سان یات سن جمع‌آوری شد. در گروه اعتبارسنجی خارجی، ۴۸ مورد ندول خوش‌خیم، ۳۹ مورد آدنوکارسینوم ریه مرحله اول از بیمارستان وابسته اول دانشگاه سان یات سن و ۲۴ مورد آدنوکارسینوم ریه مرحله اول از بیمارستان سرطان ژنگژو وجود داشت. مرکز سرطان دانشگاه سان یات-سن همچنین 16 مورد سرطان ریه سلول سنگفرشی مرحله I را برای آزمایش توانایی تشخیصی طبقه‌بندی‌کننده متابولیک تعیین‌شده جمع‌آوری کرد (ویژگی‌های بیمار در جدول تکمیلی 5 نشان داده شده است). نمونه‌هایی از گروه اکتشاف و گروه اعتبارسنجی داخلی بین ژانویه 2018 و مه 2020 جمع‌آوری شدند. نمونه‌هایی برای گروه اعتبارسنجی خارجی بین آگوست 2021 و اکتبر 2022 جمع‌آوری شدند. برای به حداقل رساندن سوگیری جنسیتی، تقریباً تعداد مساوی از موارد مرد و زن به هر گروه اختصاص داده شد. تیم اکتشاف و تیم بررسی داخلی. جنسیت شرکت‌کننده بر اساس خوداظهاری تعیین شد. رضایت آگاهانه از همه شرکت‌کنندگان اخذ شد و هیچ غرامتی ارائه نشد. افراد دارای ندول خوش‌خیم، افرادی بودند که در زمان تجزیه و تحلیل، نمره سی‌تی‌اسکن پایدار در 2 تا 5 سال داشتند، به جز 1 مورد از نمونه اعتبارسنجی خارجی که قبل از عمل جمع‌آوری و توسط هیستوپاتولوژی تشخیص داده شد. به استثنای برونشیت مزمن. موارد آدنوکارسینوم ریه قبل از برداشتن ریه جمع‌آوری و با تشخیص پاتولوژیک تأیید شدند. نمونه‌های خون ناشتا در لوله‌های جداسازی سرم بدون هیچ گونه ضد انعقادی جمع‌آوری شدند. نمونه‌های خون به مدت ۱ ساعت در دمای اتاق لخته شدند و سپس به مدت ۱۰ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتیگراد با سرعت ۲۸۵۱ × g سانتریفیوژ شدند تا مایع رویی سرم جمع‌آوری شود. نمونه‌های سرم تا زمان استخراج متابولیت در دمای ۸۰- درجه سانتیگراد منجمد شدند. بخش پیشگیری از سرطان و معاینات پزشکی مرکز سرطان دانشگاه سان یات-سن، نمونه سرمی را از ۱۰۰ اهداکننده سالم، شامل تعداد مساوی از مردان و زنان ۴۰ تا ۵۵ ساله، جمع‌آوری کرد. حجم‌های مساوی از هر نمونه اهداکننده مخلوط شد، نمونه حاصل به صورت جداگانه تقسیم و در دمای ۸۰- درجه سانتیگراد نگهداری شد. مخلوط سرم به عنوان ماده مرجع برای کنترل کیفیت و استانداردسازی داده‌ها استفاده شد.
سرم مرجع و نمونه‌های آزمایش از حالت انجماد خارج شدند و متابولیت‌ها با استفاده از روش استخراج ترکیبی (MTBE/متانول/آب) 56 استخراج شدند. به طور خلاصه، 50 میکرولیتر سرم با 225 میکرولیتر متانول سرد و 750 میکرولیتر متیل ترت-بوتیل اتر (MTBE) سرد مخلوط شد. مخلوط را هم بزنید و به مدت 1 ساعت روی یخ انکوبه کنید. سپس نمونه‌ها با 188 میکرولیتر آب با درجه MS حاوی استانداردهای داخلی (13C-لاکتات، 13C3-پیروات، 13C-متیونین و 13C6-ایزولوسین، خریداری شده از آزمایشگاه‌های ایزوتوپ کمبریج) مخلوط و ورتکس شدند. سپس مخلوط به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد با سرعت 15000 × g سانتریفیوژ شد و فاز پایینی برای تجزیه و تحلیل LC-MS در حالت‌های مثبت و منفی به دو لوله (هر کدام 125 میکرولیتر) منتقل شد. در نهایت، نمونه در یک دستگاه تغلیظ خلاء با سرعت بالا تبخیر و خشک شد.
متابولیت‌های خشک‌شده در ۱۲۰ میکرولیتر از ۸۰٪ استونیتریل بازسازی شدند، به مدت ۵ دقیقه ورتکس شدند و به مدت ۱۰ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتیگراد با سرعت ۱۵۰۰۰ × g سانتریفیوژ شدند. مواد رویی برای مطالعات متابولومیک به ویال‌های شیشه‌ای کهربایی با میکرواینسرت منتقل شدند. تجزیه و تحلیل متابولومیک غیرهدفمند بر روی یک پلتفرم کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا-طیف‌سنجی جرمی با وضوح بالا (UPLC-HRMS). متابولیت‌ها با استفاده از یک سیستم Dionex Ultimate 3000 UPLC و یک ستون ACQUITY BEH Amid (۲.۱ × ۱۰۰ میلی‌متر، ۱.۷ میکرومتر، Waters) جداسازی شدند. در حالت یون مثبت، فازهای متحرک ۹۵٪ (A) و ۵۰٪ استونیتریل (B) بودند که هر کدام حاوی ۱۰ میلی‌مول در لیتر استات آمونیوم و ۰.۱٪ اسید فرمیک بودند. در حالت منفی، فازهای متحرک A و B به ترتیب حاوی 95% و 50% استونیتریل بودند، هر دو فاز حاوی 10 میلی‌مول در لیتر استات آمونیوم، pH = 9 بودند. برنامه گرادیان به شرح زیر بود: 0-0.5 دقیقه، 2% بور؛ 0.5-12 دقیقه، 2-50% بور؛ 12-14 دقیقه، 50-98% بور؛ 14-16 دقیقه، 98% بور؛ 16-16.1 دقیقه، 98-2% بور؛ 16.1-20 دقیقه، 2% بور. ستون در دمای 40 درجه سانتیگراد و نمونه در دمای 10 درجه سانتیگراد در نمونه‌بردار خودکار نگهداری شد. سرعت جریان 0.3 میلی‌لیتر در دقیقه و حجم تزریق 3 میکرولیتر بود. یک طیف‌سنج جرمی Q-Exactive Orbitrap (ساخت شرکت Thermo Fisher Scientific) با منبع یونیزاسیون الکترواسپری (ESI) در حالت اسکن کامل راه‌اندازی و با حالت مانیتورینگ ddMS2 جفت شد تا حجم زیادی از داده‌ها را جمع‌آوری کند. پارامترهای طیف‌سنجی جرمی به شرح زیر تنظیم شدند: ولتاژ اسپری +3.8 کیلوولت/-3.2 کیلوولت، دمای مویینگی 320 درجه سانتیگراد، گاز محافظ 40 آرب، گاز کمکی 10 آرب، دمای گرم‌کن پروب 350 درجه سانتیگراد، محدوده اسکن 70 تا 1050 متر مکعب بر ساعت، وضوح 70000. داده‌ها با استفاده از Xcalibur 4.1 (ساخت شرکت Thermo Fisher Scientific) به دست آمدند.
برای ارزیابی کیفیت داده‌ها، نمونه‌های کنترل کیفیت (QC) تجمیعی با حذف 10 میکرولیتر از محلول رویی از هر نمونه تولید شدند. شش تزریق نمونه کنترل کیفیت در ابتدای توالی تحلیلی برای ارزیابی پایداری سیستم UPLC-MS تجزیه و تحلیل شدند. سپس نمونه‌های کنترل کیفیت به صورت دوره‌ای به دسته وارد می‌شوند. هر 11 دسته نمونه سرم در این مطالعه توسط LC-MS تجزیه و تحلیل شدند. بخش‌هایی از مخلوط مخزن سرم از 100 اهداکننده سالم به عنوان ماده مرجع در دسته‌های مربوطه برای نظارت بر فرآیند استخراج و تنظیم اثرات دسته به دسته استفاده شد. تجزیه و تحلیل متابولومیک غیر هدفمند از گروه اکتشاف، گروه اعتبارسنجی داخلی و گروه اعتبارسنجی خارجی در مرکز متابولومیک دانشگاه سان یات-سن انجام شد. آزمایشگاه خارجی مرکز تجزیه و تحلیل و آزمایش دانشگاه فناوری گوانگدونگ نیز 40 نمونه از گروه خارجی را برای آزمایش عملکرد مدل طبقه‌بندی کننده تجزیه و تحلیل کرد.
پس از استخراج و آماده‌سازی، سنجش کمی مطلق متابولیت‌های سرم با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بسیار بالا-طیف‌سنجی جرمی پشت سر هم (Agilent 6495 triple quadrupole) با منبع یونیزاسیون الکترواسپری (ESI) در حالت نظارت بر واکنش چندگانه (MRM) اندازه‌گیری شد. از ستون آمید ACQUITY BEH (2.1 × 100 میلی‌متر، 1.7 میکرومتر، آب) برای جداسازی متابولیت‌ها استفاده شد. فاز متحرک شامل 90% (A) و 5% استونیتریل (B) با 10 میلی‌مول در لیتر استات آمونیوم و محلول 0.1% آمونیاک بود. برنامه گرادیان به شرح زیر بود: 0-1.5 دقیقه، 0% بور؛ 1.5-6.5 دقیقه، 0-15% بور؛ 6.5-8 دقیقه، 15% بور؛ 8-8.5 دقیقه، 15%-0% بور؛ ۸.۵ تا ۱۱.۵ دقیقه، ۰٪B. ستون در دمای ۴۰ درجه سانتیگراد و نمونه در دمای ۱۰ درجه سانتیگراد در نمونه‌بردار خودکار نگهداری شد. سرعت جریان ۰.۳ میلی‌لیتر در دقیقه و حجم تزریق ۱ میکرولیتر بود. پارامترهای طیف‌سنجی جرمی (MS) به شرح زیر تنظیم شدند: ولتاژ مویرگی ±۳.۵ کیلوولت، فشار نبولایزر ۳۵ psi، جریان گاز غلاف ۱۲ لیتر در دقیقه، دمای گاز غلاف ۳۵۰ درجه سانتیگراد، دمای گاز خشک‌کن ۲۵۰ درجه سانتیگراد و جریان گاز خشک‌کن ۱۴ لیتر در دقیقه. تبدیل MRM تریپتوفان، پیروات، لاکتات، هیپوگزانتین و زانتین به ترتیب ۲۰۵.۰ تا ۱۸۷.۹، ۸۷.۰ تا ۴۳.۴، ۸۹.۰ تا ۴۳.۳، ۱۳۵.۰ تا ۹۲.۳ و ۱۵۱.۰ تا ۱۰۷.۹ بود. داده‌ها با استفاده از Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies) جمع‌آوری شدند. برای نمونه‌های سرم، تریپتوفان، پیروات، لاکتات، هیپوگزانتین و زانتین با استفاده از منحنی‌های کالیبراسیون محلول‌های مخلوط استاندارد، تعیین مقدار شدند. برای نمونه‌های سلولی، محتوای تریپتوفان نسبت به استاندارد داخلی و جرم پروتئین سلولی نرمال‌سازی شد.
استخراج پیک (m/z و زمان بازداری (RT)) با استفاده از Compound Discovery 3.1 و TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific) انجام شد. برای از بین بردن اختلافات بالقوه بین دسته‌ها، هر پیک مشخصه نمونه آزمایش بر پیک مشخصه ماده مرجع از همان دسته تقسیم شد تا فراوانی نسبی به دست آید. انحرافات استاندارد نسبی استانداردهای داخلی قبل و بعد از استانداردسازی در جدول تکمیلی 6 نشان داده شده است. تفاوت‌های بین دو گروه با نرخ کشف کاذب (FDR <0.05، آزمون رتبه‌بندی علامت‌دار ویلکاکسون) و تغییر تاخوردگی (>1.2 یا <0.83) مشخص شد. داده‌های خام MS از ویژگی‌های استخراج‌شده و داده‌های MS اصلاح‌شده با سرم مرجع به ترتیب در داده‌های تکمیلی 1 و داده‌های تکمیلی 2 نشان داده شده‌اند. حاشیه‌نویسی پیک بر اساس چهار سطح تعریف‌شده شناسایی، شامل متابولیت‌های شناسایی‌شده، ترکیبات احتمالاً حاشیه‌نویسی‌شده، کلاس‌های ترکیبات احتمالاً مشخص‌شده و ترکیبات ناشناخته 22 انجام شد. بر اساس جستجوهای پایگاه داده در Compound Discovery 3.1 (mzCloud، HMDB، Chemspider)، ترکیبات بیولوژیکی با استانداردهای معتبر منطبق با MS/MS یا حاشیه‌نویسی‌های تطبیق دقیق در mzCloud (امتیاز > 85) یا Chemspider در نهایت به عنوان واسطه بین متابولوم افتراقی انتخاب شدند. حاشیه‌نویسی‌های پیک برای هر ویژگی در داده‌های تکمیلی 3 گنجانده شده است. MetaboAnalyst 5.0 برای تجزیه و تحلیل تک متغیره فراوانی متابولیت نرمال شده با مجموع استفاده شد. MetaboAnalyst 5.0 همچنین تجزیه و تحلیل غنی‌سازی مسیر KEGG را بر اساس متابولیت‌های با تفاوت معنی‌دار ارزیابی کرد. تجزیه و تحلیل مؤلفه اصلی (PCA) و تجزیه و تحلیل تفکیک حداقل مربعات جزئی (PLS-DA) با استفاده از بسته نرم‌افزاری ropls (نسخه 1.26.4) با نرمال‌سازی پشته و مقیاس‌بندی خودکار تجزیه و تحلیل شدند. مدل بهینه نشانگر زیستی متابولیت برای پیش‌بینی بدخیمی ندول با استفاده از رگرسیون لجستیک دوتایی با حداقل انقباض مطلق و عملگر انتخاب (LASSO، بسته R نسخه 4.1-3) ایجاد شد. عملکرد مدل تشخیصی در مجموعه‌های تشخیص و اعتبارسنجی با تخمین AUC بر اساس آنالیز ROC طبق بسته pROC (نسخه 1.18.0.) مشخص شد. حد آستانه احتمال بهینه بر اساس حداکثر شاخص یودن مدل (حساسیت + ویژگی - 1) بدست آمد. نمونه‌هایی با مقادیر کمتر یا بیشتر از آستانه، به ترتیب به عنوان ندول‌های خوش‌خیم و آدنوکارسینوم ریه پیش‌بینی می‌شوند.
سلول‌های A549 (#CCL-185، مجموعه کشت نوع آمریکایی) در محیط F-12K حاوی 10٪ FBS کشت داده شدند. توالی‌های RNA سنجاق سری کوتاه (shRNA) که SLC7A5 را هدف قرار می‌دهند و یک کنترل غیرهدفمند (NC) به ناقل لنتی‌ویروسی pLKO.1-puro وارد شدند. توالی‌های آنتی‌سنس shSLC7A5 به شرح زیر است: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′)، Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). آنتی‌بادی‌های SLC7A5 (#5347) و توبولین (#2148) از Cell Signaling Technology خریداری شدند. آنتی‌بادی‌های SLC7A5 و توبولین با رقت 1:1000 برای آنالیز وسترن بلات استفاده شدند.
تست استرس گلیکولیتیک اسب دریایی XF سطح اسیدی شدن خارج سلولی (ECAR) را اندازه‌گیری می‌کند. در این سنجش، گلوکز، الیگومایسین A و 2-DG به ترتیب برای آزمایش ظرفیت گلیکولیتیک سلولی که توسط ECAR اندازه‌گیری شده بود، تجویز شدند.
سلول‌های A549 که با کنترل غیر هدفمند (NC) و shSLC7A5 (Sh1، Sh2) ترانسفکت شده بودند، به مدت یک شب در ظروف با قطر 10 سانتی‌متر کشت داده شدند. متابولیت‌های سلولی با 1 میلی‌لیتر متانول آبی 80٪ سرد استخراج شدند. سلول‌های موجود در محلول متانول جدا شده، در یک لوله جدید جمع‌آوری شدند و به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد با سرعت 15000 × g سانتریفیوژ شدند. 800 میکرولیتر از محلول رویی را جمع‌آوری کرده و با استفاده از یک دستگاه تغلیظ خلاء با سرعت بالا خشک کنید. سپس پلت‌های متابولیت خشک شده برای تعیین سطح تریپتوفان با استفاده از LC-MS/MS همانطور که در بالا توضیح داده شد، تجزیه و تحلیل شدند. سطح NAD(H) سلولی در سلول‌های A549 (NC و shSLC7A5) با استفاده از یک کیت رنگ‌سنجی کمی NAD+/NADH (#K337، BioVision) طبق دستورالعمل سازنده اندازه‌گیری شد. سطح پروتئین برای هر نمونه اندازه‌گیری شد تا مقدار متابولیت‌ها نرمال شود.
هیچ روش آماری برای تعیین اولیه حجم نمونه استفاده نشد. مطالعات متابولومیکس قبلی با هدف کشف نشانگر زیستی15،18 به عنوان معیارهایی برای تعیین اندازه در نظر گرفته شده‌اند و در مقایسه با این گزارش‌ها، نمونه ما کافی بود. هیچ نمونه‌ای از گروه مطالعه حذف نشد. نمونه‌های سرم به طور تصادفی به یک گروه اکتشافی (306 مورد، 74.6٪) و یک گروه اعتبارسنجی داخلی (104 مورد، 25.4٪) برای مطالعات متابولومیکس غیر هدفمند اختصاص داده شدند. ما همچنین به طور تصادفی 70 مورد از هر گروه را از مجموعه اکتشافی برای مطالعات متابولومیکس هدفمند انتخاب کردیم. محققان در طول جمع‌آوری و تجزیه و تحلیل داده‌های LC-MS نسبت به تخصیص گروه‌ها کور بودند. تجزیه و تحلیل آماری داده‌های متابولومیکس و آزمایش‌های سلولی در بخش‌های مربوط به نتایج، شرح شکل‌ها و روش‌ها شرح داده شده است. تعیین مقدار تریپتوفان سلولی، NADT و فعالیت گلیکولیتیک سه بار به طور مستقل با نتایج یکسان انجام شد.
برای اطلاعات بیشتر در مورد طرح مطالعه، به چکیده گزارش نمونه کارهای طبیعی مرتبط با این مقاله مراجعه کنید.
داده‌های خام MS از ویژگی‌های استخراج‌شده و داده‌های MS نرمال‌شده سرم مرجع به ترتیب در داده‌های تکمیلی ۱ و داده‌های تکمیلی ۲ نشان داده شده‌اند. حاشیه‌نویسی‌های پیک برای ویژگی‌های افتراقی در داده‌های تکمیلی ۳ ارائه شده‌اند. مجموعه داده LUAD TCGA را می‌توان از https://portal.gdc.cancer.gov/ دانلود کرد. داده‌های ورودی برای رسم نمودار در داده‌های منبع ارائه شده است. داده‌های منبع برای این مقاله ارائه شده است.
گروه مطالعات ملی غربالگری ریه و غیره. کاهش مرگ و میر ناشی از سرطان ریه با توموگرافی کامپیوتری با دوز پایین. شمال انگلستان. مجله پزشکی. 365، 395-409 (2011).
کرامر، بی. اس، برگ، کی. دی، آبرل، دی. آر و پرافت، پی. سی. غربالگری سرطان ریه با استفاده از سی‌تی‌اسکن مارپیچی با دوز پایین: نتایج حاصل از مطالعه ملی غربالگری ریه (NLST). مجله پزشکی اسکرین 18، 109–111 (2011).
دِکونینگ، اچ‌جی، و همکاران. کاهش مرگ و میر ناشی از سرطان ریه با غربالگری سی‌تی‌اسکن حجمی در یک کارآزمایی تصادفی. شمال انگلستان. مجله پزشکی. 382، 503–513 (2020).