CRISPR) یک تکنیک ویرایش ژنوم نسل سوم است: CRISPR جهان را متحول کرد

توالی‌های کوتاه پالیندرومیک فاصله‌دار منظم خوشه‌ای (CRISPR) یک تکنیک ویرایش ژنوم نسل سوم است که با نتایج با توان عملیاتی بالا، جهان را متحول کرده است. این تکنیک برای درمان بیماری‌های مختلف بیولوژیکی و عفونت‌ها استفاده شده است. باکتری‌های مختلف و سایر پروکاریوت‌ها (مانند آرکی‌ها) نیز دارای سیستم‌های CRISPR/Cas9 برای دفاع در برابر فاژها هستند. گزارش شده است که استراتژی‌های مبتنی بر CRISPR/Cas9 می‌توانند با هدف قرار دادن ژن‌های مقاومت، رونویسی و تنظیم اپی‌ژنتیکی که به طور بالقوه تغییر یافته‌اند، رشد و پیشرفت سرطان سینه سه‌گانه منفی (TNBC) را مهار کنند. این مداخلات درمانی ممکن است به رفع مشکلات چالش‌برانگیزی مانند مقاومت دارویی که حتی در TNBC مشاهده می‌شود، کمک کند. در حال حاضر، روش‌های مختلفی برای رساندن CRISPR/Cas9 به سلول‌های هدف استفاده می‌شود، مانند روش‌های فیزیکی (میکرواینجکشن، الکتروپوریشن و حالت‌های هیدرودینامیکی)، ویروسی (ویروس مرتبط با آدنو و لنتی ویروس) و غیر ویروسی (لیپوزوم‌ها و نانوذرات لیپیدی). اگرچه مدل‌های مختلفی برای مطالعه علل مولکولی TNBC توسعه داده شده‌اند، اما فقدان روش‌های حساس و هدفمند برای ارائه ابزارهای ویرایش ژنوم در داخل بدن، کاربرد بالینی آنها را محدود می‌کند. به طور خلاصه، این بررسی به طور جامع پیشرفت، چالش‌ها، محدودیت‌ها و چشم‌اندازهای درمان CRISPR/Cas9 برای TNBC را بر اساس شواهد موجود بررسی می‌کند. ما همچنین نشان می‌دهیم که چگونه ترکیب هوش مصنوعی و یادگیری ماشین می‌تواند استراتژی‌های CRISPR/Cas9 را در درمان TNBC بهبود بخشد.
سرطان با تقسیم سلولی کنترل نشده، اختلال در نقاط بازرسی چرخه سلولی و جهش در ژن‌های سرکوبگر تومور (TSGs) مشخص می‌شود (Matthews et al., 2022). در میان انواع مختلف سرطان، سرطان پستان شایع‌ترین نوع سرطان در زنان است و میزان مرگ و میر بالایی در سراسر جهان دارد (Waks and Winer, 2019). سرطان پستان یک بیماری ناهمگن با ویژگی‌های متنوع، مانند ویژگی‌های بافت‌شناسی و بیولوژیکی، تظاهرات بالینی و رفتار و پاسخ به درمان است (Weigelt et al., 2010). طبقه‌بندی سرطان پستان بینش دقیقی برای تشخیص سرطان پستان و پیش‌آگهی تومور ارائه می‌دهد. استفاده از نشانگرهای زیستی رایج و ویژگی‌های بالینی-پاتولوژیک، معیار اصلی طبقه‌بندی سرطان پستان بوده است (Tsang and Tse, 2019). پیش‌آگهی و پاسخ به درمان سرطان پستان تحت تأثیر عوامل متعددی از جمله وجود گیرنده استروژن (ER)، گیرنده پروژسترون (PR)، گیرنده فاکتور رشد اپیدرمی انسانی 2 (HER2/neu) و درجه بافت‌شناسی، نوع و درجه تومور قرار دارد. اندازه و متاستاز غدد لنفاوی (Al-Tubaiti, 2020). پنج زیرگروه مولکولی ذاتی سرطان پستان شناسایی شده است، از جمله لومینال A، لومینال B، غنی از HER2، شبه بازال و کلودین پایین (Prat et al., 2015). TNBC یک زیرگروه مولکولی از سرطان است که تمام ER، PR و HER2 را بیان نمی‌کند (Yin et al., 2020). این ویژگی‌های پاتولوژیک با TNBC مرتبط هستند و پیشرفت سریع و ماهیت تهاجمی‌تر آن را نسبت به هر نوع سرطان پستان دیگر تأیید می‌کنند (Feng et al., 2018). علاوه بر این، پرو و ​​همکارانش (2000) از فناوری ریزآرایه برای طبقه‌بندی مجدد سرطان پستان و شناسایی پنج زیرگروه ذاتی سرطان پستان استفاده کردند (Cadenas, 2012). سرطان پستان شبه بازال، زیرگروهی از سرطان پستان است که فنوتیپ سه‌گانه منفی دارد و با پیشرفت سریع همراه است. لازم به ذکر است که همه سرطان‌های سینه شبه‌بازال معمولاً به اشتباه به عنوان TNBC تشخیص داده می‌شوند، اما تنها 77٪ از آنها TNBC هستند. در مقابل، 71 تا 91 درصد از TNBC ها شبه‌بازال هستند که نشان می‌دهد این دو نوع سرطان سینه با هم همپوشانی دارند و طبقه‌بندی‌های متفاوتی را نشان می‌دهند (Wang D.-Y. و همکاران، 2019). این امر نیاز به توصیف ناهمگونی TNBC را برای روشن شدن پیش‌آگهی و شناسایی پاسخ‌های بالقوه به درمان‌های فعلی و آینده ایجاد می‌کند. علاوه بر این، TNBC 15 تا 20 درصد از کل موارد سرطان سینه را تشکیل می‌دهد و در زنان زیر 50 سال شایع‌تر است. جهش‌های BRCA1 یا BRCA2 تقریباً در 20٪ از موارد TNBC گزارش شده است (Xie و همکاران، 2017؛ Tzikas و همکاران، 2017). ، 2020). مطالعات همچنین نشان داده‌اند که TNBC دارای یک ریزمحیط ایمنی متمایز است که شامل سطوح بالایی از فاکتورهای رشد اندوتلیال عروقی، ماکروفاژهای مرتبط با تومور (TAMs)، لنفوسیت‌های نفوذکننده به تومور (TILs) و سایر مولکول‌های دخیل در رشد و مهاجرت تومور است. بنابراین، درک ریزمحیط TNBC برای پیش‌آگهی و درمان آن بسیار مهم است (Fan and He, 2022).
برای ارزیابی پیش‌آگهی TNBC و اطمینان از درمان مؤثر، تشخیص دقیق، عمدتاً مبتنی بر ایمونوهیستوشیمی (IHC) برای تشخیص ER، PR و HER2، و ماموگرافی برای تشخیص نئوپلاسم‌های پستان، مهم است. با این حال، ماموگرافی نمی‌تواند ویژگی‌های داخل توموری مانند نکروز و فیبروز را به طور کافی نشان دهد (دیپاک سینگ و همکاران، 2021). از آنجایی که پیش‌آگهی و تشخیص ضعیف مانع از تجویز داروهای مناسب توسط پزشکان می‌شود (چاودهاری، 2020)، از استراتژی‌های مختلفی برای بهبود مراقبت از بیماران مبتلا به TNBC استفاده می‌شود. در حال حاضر، دو دارو، دوکسوروبیسین و سیکلوفسفامید، در بیماران مبتلا به TNBC استفاده می‌شوند و نتایج خوبی نشان داده‌اند. علاوه بر این، از سایر داروهای پلاتینی مانند کاربوپلاتین و سیس پلاتین نیز استفاده می‌شود (سیکوف و همکاران، 2015). علاوه بر این، مهارکننده‌های PARP مانند اولاپاریب، ولاپاریب و PF-01367338 به عنوان داروهای شیمی‌درمانی بالقوه برای درمان TNBC استفاده شده‌اند (ایشینو و همکاران، ۲۰۱۸). از آنجایی که گزارش شده است که مسیرهای سیگنالینگ Wnt/b-Catenin، NOTCH و Hedgehog در بروز و پیشرفت TNBC نقش دارند، هدف قرار دادن داروها به این مسیرها ممکن است یک استراتژی مهم باشد (آیسولا و همکاران، ۲۰۱۳). اگرچه جراحی، پرتودرمانی و شیمی‌درمانی امروزه همچنان به عنوان درمان اصلی TNBC مطرح هستند، اما پیشرفت‌های قابل توجهی در توسعه درمان‌های جدید از جمله درمان هدفمند، ایمونوتراپی، ابزارهای مختلف ویرایش ژن مرتبط با CRISPR مانند Cas9n، dCas9، CRISPR/Cas12، ویرایش اولیه و ژن‌درمانی هدفمند CRISPR/Cas9 حاصل شده است. در اینجا ما بر روی ابزارهای مختلف ویرایش ژن مرتبط با CRISPR که در درمان TNBC استفاده می‌شوند، تمرکز خواهیم کرد. در میان آنها، CRISPR/Cas9 توجه گسترده‌ای را به خود جلب کرده است.
Cas9n که با نام Cas9 nickase نیز شناخته می‌شود، نوعی پروتئین Cas9 است که از طریق مهندسی ژنتیک از سیستم ویرایش ژنوم CRISPR/Cas9 مشتق شده است (Gupta et al., 2019). پروتئین Cas9 در شکل اصلی خود حاوی دو دامنه نوکلئازی است: RuvC و HNH که عملکرد اصلی آنها برش هر دو رشته DNA است. با این حال، در Cas9n، یکی از دامنه‌های نوکلئازی، HNH، از نظر ژنتیکی جهش یافته و غیرفعال می‌شود. بنابراین، دامنه HNH Cas9n غیرفعال باقی می‌ماند. فقط دامنه RuvC فعال باقی می‌ماند و به Cas9n اجازه می‌دهد تا رشته‌های DNA تکی را برش دهد یا شکستگی ایجاد کند (Trevino and Zhang, 2014). در مقایسه با Cas9، Cas9n می‌تواند به طور مؤثر اثرات خارج از هدف را کاهش داده و مکانیسم‌های ترمیم سلولی را به طور دقیق بهبود بخشد. Cas9n می‌تواند برای حل مشکلات مختلفی مانند ایجاد شکستگی در مکان‌های خاص در DNA دو رشته‌ای استفاده شود. برای این منظور، دو مولکول Cas9n با هم ترکیب و مورد استفاده قرار گرفتند (Yee, 2016). کیناز رده مختلط 3 (MLK3) یک پروتئین کیناز فعال شده با میتوژن است که به عنوان یک تنظیم کننده کلیدی در طول متاستاز TNBC عمل می‌کند (Cronan et al., 2012).
MLK3 می‌تواند مسیرهای سیگنالینگ متعددی را فعال کند که منجر به متاستاز TNBC می‌شوند. به عنوان مثال، مسیر کیناز N-ترمینال c-Jun (JNK) تحرک سلولی و تخریب ماتریکس خارج سلولی را تنظیم می‌کند و MLK3 مسیر JNK را فعال می‌کند و در نتیجه تحرک سلولی را افزایش داده و خواص تهاجمی را ایجاد می‌کند (Rattanasinchai and Gallo, 2016). MLK3 همچنین EMT را تنظیم می‌کند. برای انجام این کار، فاکتورهای رونویسی پایین‌دست مانند Snail، Slug و Twist را فعال می‌کند. این عوامل بیان نشانگرهای اپیتلیال را مهار کرده و بیان نشانگرهای مزانشیمی را افزایش می‌دهند که منجر به کسب فنوتیپ متاستاتیک می‌شود (Casalino et al., 2023). مشاهده شده است که MLK3 در بازسازی ECM و فعال‌سازی پروتئازهایی مانند متالوپروتئینازهای ماتریکس (MMPs) که ECM را تخریب می‌کنند، نقش دارد. این امر تهاجم سلول‌های تومور و گسترش آنها به مکان‌های دور را تسهیل می‌کند (Katari et al., 2019). بنابراین، مطالعات قبلی نشان داده‌اند که MLK3 نقش مهمی در TNBC ایفا می‌کند. راتاناسینچای و گالو از مدل‌های TNBC برای مطالعه نقش MLK3 استفاده کردند و دریافتند که این ژن از طریق مسیرهای سیگنالینگ خاص، توسعه سرطان را تقویت می‌کند. آنها از CRISPR/Cas9n برای ویرایش MLK3 استفاده کردند و کاهش قابل توجهی در متاستاز TNBC مشاهده کردند (Rattanasinchai and Gallo, 2016).
dCas9 که اغلب Cas9 غیرفعال نامیده می‌شود، یک مشتق اصلاح‌شده از پروتئین Cas9 است. برخلاف Cas9 فعال، dCas9 فاقد فعالیت اندونوکلئازی است و این امر آن را قادر به القای شکست‌های دو رشته‌ای DNA نمی‌کند. بنابراین، dCas9 می‌تواند برای هدف‌گیری دقیق مناطق خاص ژنوم بدون هیچ تغییر یا اصلاحی در توالی DNA مورد استفاده قرار گیرد (Wang et al., 2016). در dCas9، دو پروتئین اندونوکلئازی، RuvC و HNH، با سرکوب بقایای مهم اسید آمینه غیرفعال می‌شوند. (Richter et al., 2016). علیرغم عدم فعالیت برش DNA، dCas9 نقش‌های مهمی در تحقیقات ژنتیکی و بیوتکنولوژی ایفا می‌کند. به عنوان مثال، امکان تجسم مناطق خاص ژنوم را فراهم می‌کند، تنظیم رونویسی را تسهیل می‌کند و تغییرات اپی‌ژنتیکی را ارتقا می‌دهد (Brocken et al., 2018).
فاکتور رونویسی ZEB1 (هوموباکس متصل شونده به جعبه E انگشت روی 1) نقش ویژه و حیاتی در واسطه‌گری گذار اپیتلیال-مزانشیمی (EMT) ایفا می‌کند، یک فرآیند سلولی که در طول رشد جنینی، ترمیم بافت و پیشرفت سرطان رخ می‌دهد. این فرآیند شامل تبدیل سلول‌های اپیتلیال به سلول‌های مزانشیمی است که منجر به تغییراتی در مورفولوژی سلول، تحرک، تهاجم و غیره می‌شود (وو و همکاران، 2020). ZEB1 نشانگرهای اپیتلیال متعددی مانند E-cadherin و Occludin را مهار می‌کند که مسئول حفظ چسبندگی سلول به سلول و قطبیت سلول‌های اپیتلیال در TNBC هستند (مورنو-بوئنو و همکاران، 2008). علاوه بر این، ZEB1 نشانگرهای خاصی مانند N-cadherin، vimentin و fibronectin را فعال می‌کند (Konradi و همکاران، ۲۰۱۴) و همچنین ژن‌های دخیل در بازسازی اسکلت سلولی مانند Rho GTPaseها و ماتریکس متالوپروتئینازها (MMPها) را تنظیم می‌کند (Huang و همکاران، ۲۰۱۴). ۲۰۲۲)، علاوه بر این، بر مسیرهای سیگنالینگ مختلفی مانند فاکتور رشد تغییر شکل دهنده-β (TGF-β)، سیگنالینگ Wnt و غیره نیز تأثیر می‌گذارد و در نتیجه تهاجم و متاستاز تومور را در TNBC افزایش می‌دهد (Chen و همکاران، ۲۰۱۶). مطالعات و شواهد علمی متعدد نشان می‌دهد که ZEB1 پتانسیل بالایی به عنوان یک عامل ارزشمند برای تشخیص و مداخله درمانی TNBC دارد. در یک مطالعه اخیر، Waryah و همکاران از یک مدل TNBC استفاده کردند و توسط dCas9 به سرکوب کامل ZEB1 دست یافتند. بنابراین، آنها اختصاصیت بسیار بالا و مهار تقریباً کامل ZEB1 را در شرایط درون‌تنی (in vivo) مشاهده کردند (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 یک ابزار ویرایش ژن به نام CRISPR/Cpf1 است. این ابزار از سیستم CRISPR/Cas مشتق شده است، که در آن اصطلاح Cas12 به پروتئین 12 مرتبط با CRISPR اشاره دارد (Bharathkumar و همکاران، 2022)، که کاملاً شبیه Cas9 است. تنها تفاوت این است که حاوی پروتئین Cas12 است. در مقایسه با Cas9، Cas12 عملکردهای منحصر به فردی مانند تولید انتهای چسبنده در طول فرآیند ویرایش ژن دارد، در حالی که Cas9 انتهای صاف تولید می‌کند (Wang و همکاران، 2021). این ویژگی Cas12 به فناوری خاص دستکاری DNA آن کمک می‌کند. به عنوان پروتئینی که قادر به تشخیص دقیق و برش DNA هدف است، تطبیق‌پذیری فوق‌العاده‌ای دارد و آن را به ابزاری مؤثر برای کاربردهای مختلف، از جمله ویرایش ژن، تبدیل می‌کند (Pickar-Oliver و Gersbach، 2019).
مشابه سایر انواع CRISPR، CRISPR/Cas12 همچنین قادر به از کار انداختن یا فعال کردن ژن‌ها در TNBC است و ژن‌هایی را هدف قرار می‌دهد که نقش مهمی در پاتوژنز یا پاسخ به درمان دارند (یانگ و ژانگ، 2023). برای انجام این فرآیند، یک RNA راهنما (gRNA) توسعه داده شد که Cas12 را به ژن هدف هدایت می‌کند. هنگامی که Cas12 به هدف خود متصل می‌شود، شکست‌های دو رشته‌ای را در DNA ایجاد می‌کند و مکانیسم‌های ترمیم DNA را فعال می‌کند. در طول فرآیند ترمیم، ممکن است نوکلئوتیدهای نادرست گنجانده شوند که منجر به جهش‌های ژنی و از دست دادن عملکرد می‌شود (ژانگ و همکاران، 2021a). علاوه بر این، یک نسخه بهبود یافته از آنزیم Cas12 (به نام dCas12) نیز برای فعال کردن ژن‌ها استفاده شد. با ترکیب آن با یک فعال‌کننده رونویسی، می‌توان ژن‌های خاصی را القا کرد و در نتیجه آنها را فعال کرد. این فناوری پتانسیل بالایی در تقویت فعال‌سازی ژن‌های سرکوب‌کننده تومور دارد (سلطان و همکاران، 2022).
ویرایش اولیه یک فناوری ویرایش ژنومی جدید و بسیار برتر است. این فناوری قادر به اصلاح بسیار دقیق DNA یک موجود زنده است (Chen and Liu, 2023). ویرایش اولیه از طریق ادغام دو جزء اصلی حاصل می‌شود: یک آنزیم CRISPR/Cas9 اصلاح‌شده و ترانس کریپتاز معکوس. نقش آنزیم CRISPR/Cas9 هدف‌گیری انتخابی مکان‌های دقیق در ژنوم است، در حالی که ترانس کریپتاز معکوس به اصلاح کامل DNA در مکان هدف کمک می‌کند (Hassan et al., 2021). در مکانیسم ویرایش آغازگر، اولین مرحله شامل ایجاد یک RNA راهنمای ویرایش آغازگر (pegRNA) است (Standage-Beier et al., 2021). این RNA حاوی توالی هدف و الگوی RNA مربوط به مکان ویرایش مورد نظر در DNA هدف است. سپس pegRNA به همراه یک نوکلئاز ویرایش آغازگر (PE2) به سلول‌های هدف وارد می‌شود. PE2 یک پروتئین ترکیبی است که از یک آنزیم Cas9، یک ترانس کریپتاز معکوس و یک آداپتور ویرایش آغازگر تشکیل شده است (Martín-Alonso et al., 2021). درون سلول، کمپلکس‌های pegRNA و PE2 به دنبال DNA خاصی که می‌خواهند اصلاح کنند، می‌گردند. آنزیم Cas9، DNA را برش می‌دهد و الگویی متشکل از رشته‌های تکی ایجاد می‌کند (Choi و همکاران، 2022). آنزیم رونویسی معکوس از این الگو برای آماده‌سازی DNA برای ویرایش استفاده می‌کند. همراه با کپی کردن DNA، دستورالعمل‌هایی برای ویرایش الگوی RNA نیز گنجانده شده است. در نهایت، رشته DNA تازه ایجاد شده به عنوان الگو برای ترمیم شکستگی در DNA استفاده می‌شود و در نتیجه یک توالی DNA تغییر یافته حاوی اصلاح مورد نظر ایجاد می‌شود (Ochoa-Sanchez و همکاران، 2021). مکانیسم‌های ویرایش پرایمر می‌توانند منجر به جهش‌های گسترده در ژن‌ها شوند. این مکانیسم‌ها می‌توانند جهش‌های نقطه‌ای، درج‌ها، حذف‌ها و حتی جایگزینی‌های ژن را هدف قرار دهند (Anzalone و همکاران، 2019؛ Chen و Liu، 2023). ویرایش اولیه مزایای متعددی نسبت به فناوری‌های قبلی ویرایش ژنوم ارائه می‌دهد. این مزایا شامل افزایش دقت، کاهش اثرات خارج از هدف و توانایی ویرایش DNA بدون تکیه بر شکست‌های دو رشته‌ای DNA است (Anzalone و همکاران، 2020).
فناوری CRISPR/Cas9 در ابتدا برای محافظت از باکتری‌ها در برابر انتقال پلاسمید و عفونت فاژ توسعه داده شد و بعداً به عنوان یک ابزار مؤثر هدف‌گیری DNA مبتنی بر RNA برای ویرایش ژنوم مورد استفاده قرار گرفت (Jiang and Doudna, 2017). علاوه بر این، گزارش شده است که سیستم CRISPR/Cas9 به ترتیب در 50٪ و 87٪ از ژنوم‌های باکتریایی و آرکی وجود دارد (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 ابزاری بالقوه برای حذف، درج و اصلاح هرگونه توالی ژنتیکی غیرطبیعی با استفاده از حالت‌های درون‌تنی (in vivo) و برون‌تنی (in vitro) است (Sabit et al., 2021). علاوه بر این، نشان داده شده است که CRISPR/Cas9 به دلیل اختصاصی بودن برای ژن‌های هدف مورد نظر، بخشی از سیستم ایمنی تطبیقی ​​​​است (Chen and Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 شامل Cas9 و یک RNA راهنمای واحد (sgRNA) است. Cas9 یک اندونوکلئاز است که از اجزای پروتئینی متعددی تشکیل شده است. علاوه بر این، Cas9 دارای خواص ساختاری و ساختاری منحصر به فردی است (Pacesa و همکاران، 2022) زیرا از دو لوب تشکیل شده است: شناسایی (REC) و نوکلئاز (NUC). لوب REC به سه ناحیه تقسیم می‌شود: REC1، REC2 و مارپیچ‌های پل (Cromwell و همکاران، 2018). NUC از سه لوب تشکیل شده است، یعنی RuvC (RuvC I، RuvC II، RuvC III)، HNH و دامنه تعامل موتیف مجاور پروتوسپر (PAM) (شکل 1) (Song و همکاران، 2016). sgRNA از دو جزء تشکیل شده است، از جمله RNA CRISPR (crRNA) و RNA کوچک ترانس کد کننده (RNA ردیاب) (شکل 1). sgRNA پروتئین Cas9 را به کانکسین‌ها متصل می‌کند تا یک کمپلکس فعال تشکیل دهد که به عنوان کمپلکس مؤثر نیز شناخته می‌شود (Richter و همکاران، ۲۰۱۲). crRNA یک جفت باز ۱۸ تا ۲۰ نوکلئوتیدی است که نقش مهمی در شناسایی توالی‌های DNA هدف ایفا می‌کند. علاوه بر این، crRNA با DNA هدف جفت می‌شود و tracrRNA به عنوان داربستی برای نوکلئاز Cas9 برای اتصال به DNA هدف عمل می‌کند (Manghwar و همکاران، ۲۰۱۹). از سوی دیگر، توالی PAM دارای ۳ نوکلئوتید است که اتصال کمپلکس مؤثر به DNA را تأیید، مشخص و واسطه‌گری می‌کند. زیر واحدهای کمپلکس پروتئین Cas9، RuvC و HNH، فعالیت کاتالیزوری دارند (Richter و همکاران، ۲۰۱۲؛ Asmamaw و Zawdie، ۲۰۲۱). دامنه نوکلئاز HNH زیر واحد Cas9، رشته DNA مرتبط با crRNA را برش می‌دهد. دامنه نوکلئاز RuvC رشته‌های دیگر DNA را می‌شکند و شکستگی‌های دو رشته‌ای (DSB) ایجاد می‌کند، که پس از آن دو مکانیسم مختلف ترمیم شکستگی DNA فعال می‌شوند (Jiang and Doudna, 2017) (شکل 1).
شکل 1. نمای کلی CRISPR/Cas9 (A). اجزای سیستم CRISPR/Cas9: (i). اندونوکلئاز Cas9 مسئول برش توالی DNA هدف است، (ii) یک RNA راهنما (sg) که از ادغام crRNA و کایمراهای tra-crRNA حاصل می‌شود. (2). Cas9 شامل چندین جزء مانند Rec I، Rec II، لوب NUC (HNH و Ruv C زیرمولفه هستند) و دامنه تعامل PAM (C) با عملکردهای مربوطه است. کمپلکس پروتئینی CRISPR/Cas9 توالی‌های DNA را به اشکال غیرمکمل و مکمل برش می‌دهد (D). CRISPR/Cas9 ژنوم را در سه مرحله ویرایش می‌کند: شناسایی، برش و ترمیم. sg-RNA طراحی شده، Cas9 را هدایت می‌کند و توالی مورد نظر را از طریق جزء مکمل crRNA شناسایی می‌کند. Cas9 توالی PAM را در 5′-NGG-3′ شناسایی می‌کند و DNA را ذوب می‌کند و یک هیبرید DNA-RNA تشکیل می‌دهد و برش را فعال می‌کند. دامنه HNH در Cas9 رشته مکمل را برش می‌دهد و دامنه RuvC رشته غیرمکمل را. CRISPR/Cas9 با شکستن dsDNA به دو روش آن را ترمیم می‌کند: اتصال انتهای غیرهمولوگ (NHEJ) و ترمیم هدایت‌شده توسط همولوژی (HDR). NHEJ DNA دو رشته‌ای را در غیاب DNA همولوگ خارجی از طریق یک فرآیند آنزیمی ترمیم می‌کند، مکانیسمی مستعد خطا که می‌تواند توالی‌های DNA تصادفی را وارد یا حذف کند. HDR بسیار اختصاصی است و به الگوهای DNA همولوگ نیاز دارد.
مسیرهای ترمیمی با واسطه CRISPR/Cas9 شامل مکانیسم‌های اتصال انتهای غیرهمولوگ (NHEJ) و ترمیم هدایت‌شده با همولوژی (HDR) هستند. NHEJ یک مسیر مستعد خطا است زیرا شامل درج یا حذف است و در طول مکانیسم ترمیم به هیچ الگویی نیاز ندارد. از نوکلئوتیدهای تصادفی برای تولید پروتئین‌های استاندارد استفاده می‌کند (Abbasi et al., 2021). این سیستم ترمیمی شامل چهار کمپلکس مانند کمپلکس KU، کمپلکس پروتئینی مکمل متقاطع نوع 4 (XRCC-4)، آنزیم پردازش انتهای DNA و پروتئین کیناز DNA-PKcs است (Abbasi et al., 2021). پروتئین کمپلکس KU دارای دو زیر واحد، Ku 70 و Ku 80 است و نقش مهمی در مکانیسم NHEJ ایفا می‌کند، زیرا مکانیسم ترمیم با اتصال دو زیر واحد (Ku 70 و Ku 80) به انتهای صاف یا تقریباً صاف DNA هدف آغاز می‌شود (Abbasi و همکاران، 2021)، که به عنوان داربستی برای جذب سایر عوامل مرتبط با NHEJ به محل آسیب عمل می‌کند (Yang و همکاران، 2020). XRCC-4 و DNA لیگاز به ترتیب از 334 و 911 اسید آمینه تشکیل شده‌اند و کمپلکس XRCC4-DNA لیگاز IV اتصال انتهای DNA را تحریک می‌کند (Chatterjee و همکاران، 2015). آنزیم پردازش انتهای DNA، که به عنوان پلی نوکلئوتید کیناز 3'-فسفات نیز شناخته می‌شود، یک آنزیم پردازش انتهای DNA است. این آنزیم می‌تواند گروه 3'P را در DNA حذف کرده و گروه 5'OH را در طول ترمیم DSB فسفریله کند. همچنین شامل ترمیم شکستگی‌های تک رشته‌ای (SSBs) با استفاده از مسیر ترمیم SSB است (Chatterjee و همکاران، 2015). پروتئین کیناز DNA-PKcs یک پروتئین کیناز وابسته به DNA است که از یک زیر واحد کاتالیزوری از خانواده PIKKها (کینازهای مرتبط با فسفاتیدیل اینوزیتول 3-کیناز) و آتاکسی تلانژکتازی جهش‌یافته (ATM) و همچنین ATRهای مرتبط با ATM و Rad3 تشکیل شده است. شکستگی‌های رشته‌ای (DSBs) و شکستگی‌های تک رشته‌ای (Yue و همکاران، 2020؛ Peng و همکاران، 2016).
HDR یک مکانیسم ترمیم دقیق‌تر و مناسب‌تر است زیرا اطلاعات با استفاده از شکل دست نخورده‌ی دو رشته‌ای DNA همولوگ کپی می‌شود، اگرچه به حضور کروماتیدهای خواهری نیاز دارد. این اتفاق در فاز S/G2 چرخه سلولی پستانداران رخ می‌دهد. HDR عمدتاً در گونه‌های مخمر رخ می‌دهد، اما NHEJ در پستانداران حیاتی است (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). مکانیسم کامل ترمیم در شکل 1 نشان داده شده است.
از آنجایی که TNBC ناشی از ناهنجاری‌های ژنتیکی و اپی‌ژنتیکی است، اصلاح ناهنجاری‌های بدخیم ژنومی/اپی‌ژنومی با استفاده از CRISPR/Cas9 می‌تواند یک رویکرد درمانی معقول باشد (Chen et al., 2019). علاوه بر این، برخی از فاکتورهای رونویسی دخیل در تنظیم رونویسی اختصاصی سلول ممکن است ویژگی‌های منحصر به فردی از سلول‌های سرطانی را نشان دهند، که نشان می‌دهد تنظیم رونویسی می‌تواند یک رویکرد عالی برای درمان سرطان باشد (Drost et al., 2017). بهره‌برداری از این ویژگی‌های مولکولی تومورها، مانند نقص‌های ژنتیکی، اپی‌ژنتیکی و رونویسی، برای توسعه دارو می‌تواند نتایج بالینی را بهبود بخشد و هزینه‌های غربالگری را کاهش دهد. CRISPR یک ابزار بالقوه ویرایش ژن است که نه تنها می‌تواند اهداف ژنومی ایجادکننده سرطان را شناسایی و تشخیص دهد، بلکه می‌تواند برای ویرایش، سرکوب و اصلاح اپی‌ژنتیکی انکوژن‌ها در سلول‌های انسانی نیز استفاده شود (جدول 1) (Ahmed et al., 2021). غربالگری‌های متعددی با CRISPR برای جستجوی ژن‌های مرتبط با سرکوب‌کننده‌های تومور، انکوژن‌ها و مقاومت دارویی انجام شده است. استفاده از CRISPR/Cas9 برای ویرایش انکوژن‌های مختلف TNBC در شکل 2 نشان داده شده است.
شکل 2. ویرایش ژنی انکوژن‌های مختلف TNBC با استفاده از CRISPR/Cas9 که منجر به کاهش رشد تومور و متاستاز می‌شود. این انکوژن‌ها شامل CDK7، NAT1، UBR5، YTHDF2، ITGA9، CXCR4 و CXCR7، Crypto1، ROR1 و ST8SIA هستند که در بروز و متاستاز TNBC نقش دارند.
مهاجرت، تهاجم و گذار اپیتلیال-مزانشیمی سلول‌های سرطانی (EMT) با ITGA9 مرتبط هستند. مطالعات قبلی نشان داده‌اند که ITGA9 یک بازیگر کلیدی در مسیر Notch است و نقش جالبی در متاستاز رابدومیوسارکوم ایفا می‌کند (Molist و همکاران، 2020). علاوه بر این، مشخص شد که ITGA9 با پیش‌آگهی بیمار در چندین نوع تومور، از جمله سرطان سینه، ارتباط نزدیکی دارد (Wang Z. و همکاران، 2019). علاوه بر این، تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک ITGA9 نشان داد که بیان آن در TNBC به طور قابل توجهی بالاتر از سایر زیرگروه‌های سرطان سینه است. افزایش سطح ITGA9 با متاستاز و عود تومور در بیماران TNBC مرتبط است. حذف ITGA9 توسط CRISPR/Cas9 منجر به خواص شبه سلول‌های بنیادی سرطانی (CSC)، رگ‌زایی تومور، رشد تومور و کاهش متاستاز با ترویج تخریب β-کاتنین در TNBC شد (Wang Z. و همکاران، 2019).
کریپتو-1 عضوی از خانواده TGF-β است و برای جنین‌زایی اولیه، حفظ سلول‌های بنیادی و متاستاز سرطان حیاتی است (ایشی و همکاران، 2021). همچنین با نام Tdgf-1 شناخته می‌شود، یک پروتئین سیگنالینگ متصل به GPI انکوژنیک است که در تنظیم تشکیل رگه اولیه، مزودرم و اندودرم و همچنین ایجاد عدم تقارن چپ/راست در رشد اندام‌های بدن در طول جنین‌زایی نقش دارد (ژانگ و همکاران، 2021b). علاوه بر این، نشان داده شده است که کریپتو-1 به عنوان یک نشانگر سلول بنیادی در گذار اپیتلیال-مزانشیمی (EMT) نقش دارد (ژانگ و همکاران، 2021b). EMT نه تنها برای فرآیندهای مختلفی مانند رشد جنینی، فیبروز و بهبود زخم، بلکه برای تهاجم و متاستاز سرطان نیز حیاتی است. علاوه بر این، نشان داده شده است که کریپتو-1 با چهار گیرنده Notch تعامل دارد و بلوغ پس از ترجمه آنها را افزایش می‌دهد (Brandstadter and Maillard, 2019). مسیر سیگنالینگ Notch در حفظ سلول‌های سرطان سینه انسان نقش دارد. مطالعات نشان داده‌اند که حذف Crypto-1 با واسطه CRISPR/Cas9، رشد و متاستاز سرطان را سرکوب می‌کند. بنابراین، Crypto-1 ممکن است به یک هدف درمانی مهم برای TNBC تبدیل شود (Castro et al., 2015).
پروتئین XCL12 و گیرنده کموکاین آن CXC (CXCR4 و CXCR7) نقش‌های مختلفی در تکثیر، رشد، مهاجرت و تهاجم سلول‌های سرطانی ایفا می‌کنند (Wu و همکاران، 2015). این گیرنده‌های شیمیایی از طریق مسیرهای سیگنالینگ متعدد در مدل‌های درون‌تنی (in vivo) و برون‌تنی (in vitro) با توسعه TNBC مرتبط بوده‌اند (Wu و همکاران، 2015). علاوه بر این، فعال شدن CXCR4 و CXCR7 با حساسیت بیشتر به متاستاز و پیش‌آگهی ضعیف در TNBC مرتبط است (Karn و همکاران، 2022). بنابراین، حذف CXCR4 و CXCR7 ممکن است به ژن‌های هدف دارویی مؤثر برای درمان سرطان سینه، از جمله TNBC، تبدیل شوند. مطالعه‌ای توسط یانگ و همکاران. یانگ و همکاران (2019) از CRISPR/Cas9 برای حذف همزمان ژن‌های CXCR4 و CXCR7 استفاده کردند و دریافتند که تکثیر، رشد، مهاجرت و تهاجم TNBC به طور قابل توجهی مهار می‌شود (Yang و همکاران، 2019).
افزایش سطح miR-3662، یک انکوژن TNBC، در بافت‌های سرطان سینه مشاهده شده است (Yi و همکاران، 2022). نشان داده شده است که مهار miR-3662 رشد تومور سرطان سینه و متاستاز آن را هم در داخل بدن و هم در شرایط آزمایشگاهی مهار می‌کند (Agarwal و Gupta، 2021). HBP-1 یک مهارکننده قوی سیگنالینگ Wnt/-catenin است و احتمالاً مسئول رشد سلول‌های TNBC با واسطه miR-3662 است. اخیراً، Yi و همکاران دریافتند که محور miR-3662-HBP1 مسیر سیگنالینگ Wnt/-catenin را در سلول‌های TNBC تنظیم می‌کند (Yi و همکاران، 2022). به دلیل بیان اختصاصی تومور، miR-3662 ممکن است یک هدف درمانی بالقوه برای TNBC باشد. بنابراین، مهار miR-3662 با واسطه CRISPR/Cas9 ممکن است یک رویکرد عالی برای توسعه داروهای جدید برای درمان TNBC باشد.
UBR5 یک نوکلئوفسفوپروتئین 300 کیلودالتونی است که به عنوان تنظیم‌کننده کلیدی تومورزایی، متاستاز و پاسخ ایمنی در سرطان‌های مختلف شناسایی شده است (Shearer و همکاران، 2015؛ Fu و همکاران، 2023). گزارش شده است که UBR5 در نمونه‌های TNBC به شدت افزایش بیان می‌یابد و با القای تکثیر از طریق فعالیت لیگاز یوبیکوئیتین خود، عملکرد ERα را تحریک می‌کند (Bolt و همکاران، 2015). مطالعات توالی‌یابی کل اگزوم نمونه‌های اولیه TNBC نیز افزایش بیان UBR5 را نشان داد که نشان‌دهنده نقش آن در توسعه TNBC است. علاوه بر این، حذف UBR5 با هدایت CRISPR/Cas9، مهار قابل توجهی از متاستاز و رشد TNBC را در مدل‌های موش آزمایشگاهی نشان داد. علاوه بر این، گنجاندن UBR5 در یک مدل موش وحشی، عملکرد کامل آن را بازیابی کرد، در حالی که این اثر در سویه‌های جهش‌یافته غیرفعال مشاهده نشد (Liao و همکاران، 2017). فقدان UBR5 با افزایش آپوپتوز، نکروز و مهار رشد تومور در سرطان سینه سه‌گانه (TNBC) به دلیل رگ‌زایی ضعیف همراه است. به دلیل از دست دادن UBR5، گسترش تومور به اندام‌های دور کاهش می‌یابد و UBR5 عمدتاً با کاهش بیان E-cadherin باعث EMT غیرطبیعی می‌شود (Zhang and Weinberg, 2018). اخیراً نشان داده شده است که UBR5 به دلیل عدم فعالیت یوبیکوئیتیناسیون E3، عامل بسیار مهمی در رونویسی PDL1 القا شده توسط IFN-γ در TNBC است. تجزیه و تحلیل ترانسکریپتوم RNA نشان داد که UBR5 ممکن است اثرات سیستمیکی بر روی ژن‌های مرتبط با مسیر IFN-γ داشته باشد و با افزایش سطح فعال‌سازی RNA پروتئین کیناز (PKR) و مبدل‌ها و فعال‌کننده‌های سیگنال آن، ترانس‌فعال‌سازی PDL1 را افزایش دهد. رونویسی 1 (STAT1) و فاکتور تنظیمی اینترفرون 1 (IRF1). با این حال، حذف ترکیبی بیان UBR5 و PD-L1 با واسطه CRISPR/Cas9، اثر درمانی هم‌افزایی نسبت به مسدود کردن هر یک از آنها به تنهایی دارد و اثرات عمیقی بر ریزمحیط تومور دارد (Wu و همکاران، 2022). بنابراین، CRISPR/Cas9 ممکن است ابزاری مهم برای مهار عملکرد UBR5 باشد و در نتیجه متاستاز TNBC و رشد تومور را سرکوب کند.
ROR1 یک پروتئین غشایی نوع I است که در طول سرطان و رشد جنینی بیان می‌شود و به عنوان یک پروتئین انکوفتال شناسایی شده است (نیکلاس بورچردینگ، ۲۰۱۴). رفتار تهاجمی انواع مختلف سرطان‌های انسانی با افزایش بیان ROR1 مرتبط است. نتایج امیدوارکننده‌ای از مطالعات درون تنی و برون تنی شامل ترکیبات درمانی که ROR1 را هدف قرار می‌دهند، به دست آمده است (چیِن و همکاران، ۲۰۱۶). سطوح بالای mRNAی ROR1 در بیوپسی‌های بافت پستان نیز با تومورهای تهاجمی شبه پایه پستان (BL) و مهاجرت آنها به سایر قسمت‌های بدن مرتبط بوده است. علاوه بر این، بیان بیش از حد ROR1 به عنوان یک نشانگر پیش‌آگهی برای توسعه TNBC شناسایی شده است (چیِن و همکاران، ۲۰۱۶). با این حال، خاموش کردن ROR1 با استفاده از CRISPR/Cas9 برای سرکوب رشد و متاستاز TNBC یک استراتژی مؤثر خواهد بود.
فرآیند سیالیلاسیون شامل افزودن اسید سیالیک به گلیکوکونژوگه‌ها است که توسط سیالیل ترانسفرازها (STs) کاتالیز می‌شود. ST8SIA1 متعلق به خانواده ST است و نقش مهمی در پاتوژنز بیماری‌های مختلف مانند لوسمی لنفوسیتی و سرطان کولورکتال ایفا می‌کند (چانگ و همکاران، 2018). تجزیه و تحلیل توالی RNA نشان می‌دهد که ST8SIA1 در بافت پستان بیماران TNBC به میزان زیادی بیان می‌شود و با جهش در ژن سرکوبگر تومور p53 همبستگی مثبت دارد، که ممکن است در پاتوژنز TNBC نقش داشته باشد (باتولا و همکاران، 2017). علاوه بر این، ST8SIA1 در متاستاز و عود TNBC نقش دارد، که نشان می‌دهد نقش مهمی در وقوع و توسعه TNBC دارد. در یک مدل آزمایشگاهی TNBC، نشان داده شد که مهار ST8SIA1 توسط CRIPSR/Cas9 رشد و متاستاز را مسدود می‌کند (باتولا و همکاران، 2017). این نشان می‌دهد که CRISPR/Cas9 ممکن است ابزاری مهم برای مهار عملکرد انکوژن ST8SIA1 در درمان TNBC باشد.
NAT1 یک آنزیم متابولیک است که تشکیل ترکیبات زنوبیوتیک فاز II را کاتالیز می‌کند و تقریباً در تمام بافت‌های انسانی بیان می‌شود. NAT1 می‌تواند از کوفاکتور فولات برای هدف قرار دادن استیل-CoA (استیل-CoA) حتی در غیاب سوبسترای آمین آروماتیک استفاده کند (Stepp و همکاران، 2015؛ Laurieri و همکاران، 2014). مطالعات نشان داده‌اند که NAT1 عملکرد ماتریکس متالوپروتئیناز 9 (MMP9) را در مدل‌های سلولی سرطان پستان تنظیم می‌کند و در برابر گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) در طول گرسنگی گلوکز محافظت می‌کند (Wang و همکاران، 2018). نشان داده شده است که حذف NAT1 کمپلکس پیرووات دهیدروژناز را مهار می‌کند و منجر به اختلال عملکرد میتوکندری می‌شود (Wang L. و همکاران، 2019). علاوه بر این، گزارش‌های مختلف دیگری نشان داده‌اند که مهار NAT1 با استفاده از مولکول‌های کوچک و خاموش کردن siRNA می‌تواند تهاجم و تکثیر سلول‌های سرطان پستان را کاهش دهد (Stepp و همکاران، 2018). اخیراً، از CRISPR/Cas9 برای سرکوب NAT1 در رده سلولی سرطان سینه MDA-MB-231 استفاده شده است که بسته به سطح بیان آن، بر متابولیسم سلولی تأثیر می‌گذارد. این مطالعه همچنین نشان داد که NAT-1 برای پیشرفت و متاستاز TNBC بسیار مهم است (Carlisle et al., 2020).
رونویسی هماهنگ انکوژن‌ها توسط تقویت‌کننده‌های فوق‌العاده، فاکتورهای رونویسی و کوفاکتورها تنظیم می‌شود (Hnisz و همکاران، 2015). علاوه بر این، گروهی از کینازهای وابسته به سیکلین (CDKs)، مانند CDK7، CDK8، CDK9، CDK12 و CDK13، برای تنظیم رونویسی مورد نیاز هستند. در میان آنها، CDK7 در فسفوریلاسیون RNA پلیمراز II نقش دارد که برای شروع و گسترش رونویسی انکوژن در پاتوژنز TNBC بسیار مهم است. در یک مطالعه اولیه، حذف CDK7 توسط CRISPR/Cas9 TNBC را مهار کرد، که نشان می‌دهد پاتوژنز TNBC وابسته به CDK7 است (Wang Y. و همکاران، 2015).
مطالعات نشان داده‌اند که جهش در MYC و RBP (پروتئین متصل شونده به RNA) می‌تواند منجر به آپوپتوز شود، در حالی که جهش‌های تک ژنی در MYC یا RBP بر رشد سلول‌های سرطانی تأثیری ندارند (Einstein و همکاران، 2021). بیش از 1000 RBP در ژنوم انسان با استفاده از یک کتابخانه مبتنی بر CRISPR/Cas9 غربالگری شده‌اند. در میان آنها، مشخص شد که 57 RBP برای رشد سلول‌های سرطانی با سطح MYC بسیار بالا حیاتی هستند (Wheeler و همکاران، 2020). علاوه بر این، YTHDF2 برای حفظ رشد سلول‌های TNBC مهم است و میزان رونوشت‌های متیله شده را در طول رونویسی و ترجمه سطح بالا در سلول‌های سرطانی با بیان MYC بالاتر کاهش می‌دهد. علاوه بر این، YTHDF2 برای سلول‌های سرطانی که وابستگی کمتری به سطح بالای MYC برای طولانی‌تر کردن بقای بیماران TNBC دارند، ضروری نیست (Einstein و همکاران، 2021)، که نشان می‌دهد ممکن است یک هدف درمانی بالقوه برای داروهایی باشد که می‌توانند بر TNBC غلبه کنند.
پروتئین‌های انگشت روی (ZNFs) تقریباً 1٪ از کل ژنوم انسان را تشکیل می‌دهند. مطالعات نشان داده‌اند که ZNF می‌تواند تکثیر سلولی را در سرطان‌های مختلف، مانند سرطان کبد، سرطان سینه و سرطان روده بزرگ تنظیم کند (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). کتابخانه‌های تولید شده توسط حذف CRISPR برای غربالگری ژن‌های سرکوبگر تومور مختلف (TSGs) در سلول‌های سرطان سینه استفاده شده‌اند (Shalem et al., 2014). از آن زمان، یک مطالعه رونویسی از سلول‌های سرطان سینه حذف شده با CRISPR/Cas9 ZNF319 نشان داده است که ZNF319 یک ژن سرکوبگر تومور است که تکثیر سرطان سینه را کاهش می‌دهد و بنابراین در مکانیسم‌های سیگنالینگ بالقوه مختلف و سایر عملکردهای بیولوژیکی نقش دارد (Wang L. et al., 2022).
فروپتوز نوعی مرگ برنامه‌ریزی‌شده سلولی است که به وجود آهن وابسته است. مشخص است که توسعه فروپتوز تحت تأثیر وجود پراکسیدهای لیپیدی قرار دارد. علاوه بر این، گزارش شده است که PKCβII پراکسیداسیون لیپیدی اولیه را نشان می‌دهد و افزایش پراکسیداسیون لیپیدی با فروپتوز مرتبط است. غربالگری کتابخانه‌ای از مهارکننده‌های کیناز با واسطه CRISPR/Cas9 نشان داد که PKCβII در فرآیند پراکسیداسیون لیپیدی دخیل است که برای فروپتوز در سلول‌های MDA-MB-231 حیاتی است (Zhang و همکاران، 2022). بنابراین، این نشان می‌دهد که حذف PKCβII توسط CRISPR/Cas9 ممکن است یک هدف بالقوه ژن سرکوب‌کننده تومور برای درمان بیماری‌های مرتبط با فروپتوز باشد (Zhang و همکاران، 2022).
اعتقاد بر این است که مقاومت دارویی مسئول تقریباً 90٪ از مرگ و میر در بیماران سرطانی است و یکی از چالش‌های اصلی در درمان سرطان است (Bukowski و همکاران، 2020). نتایج نشان می‌دهد که تعداد کافی از ژن‌های مرتبط با خروج دارو، ترمیم DNA، آپوپتوز و مسیرهای مختلف سیگنالینگ سلولی با مقاومت دارویی مرتبط هستند (Haider و همکاران، 2020). در میان آنها، چندین ژن توسط ابزارهای CRISPR/Cas9 هدف قرار گرفته‌اند و نتایج امیدوارکننده‌ای در کاهش مقاومت دارویی و افزایش اثربخشی درمان‌های ضد سرطان نشان داده‌اند (Vaghari-Tabari و همکاران، 2022). علاوه بر این، کتابخانه‌های غربالگری حذف ژن CRISPR/Cas9 با توان عملیاتی بالا در اصلاح عملکرد اهداف ژنی بالقوه مقاومت دارویی نقش داشته‌اند (Shalem و همکاران، 2015). برای شناسایی ژن‌های مقاومت به پاکلیتاکسل، از توالی‌یابی RNA همراه با غربالگری کتابخانه sgRNA در سطح ژنوم برای شناسایی هشت ژن کاندید، از جمله هیستون داستیلاز 9 (HDAC9)، که با مقاومت دارویی در بیماران مبتلا به TNBC عودکننده مرتبط هستند، استفاده شد (B و همکاران، 2020). در مطالعه دیگری، افزایش بیان پروتئین کیناز دیسرین/ترئونین و تیروزین (DSTYK) در طول بقای بیماران TNBC تحت درمان با داروهای ضد سرطان مشاهده شد. علاوه بر این، مهار DSTYK با واسطه CRISPR/Cas9 به طور قابل توجهی آپوپتوز سلول‌های سرطانی مقاوم به دارو را در شرایط آزمایشگاهی (سلول‌های SUM102PT و سلول‌های MDA-MB-468) و یک مدل TNBC در داخل بدن (Ogbu و همکاران، 2021) افزایش داد.
اگرچه TNBC فعال‌سازی غیرطبیعی مسیر MAPK دارد، اما اثر بالینی درمان‌های هدفمند MEK ضعیف است. غربالگری کتابخانه ژنومی CRISPR/Cas9 نشان داد که مهار PSMG2 (چاپرون ۲ مونتاژ پروتئوم) سلول‌های TNBC BT549 و MB468 را به مهارکننده MEK، AZD6244، حساس می‌کند. مهار PSMG2 توسط CRISPR/Cas9 عملکرد طبیعی پروتئازوم را تغییر داد و منجر به جداسازی PDPK1 با واسطه اتوفاژی شد و در نتیجه سلول‌های تومور را در مدل‌های موشی TNBC القا شده توسط AZD6244 (مهارکننده MEK) و MG132 (مهارکننده پروتئازوم) بهبود بخشید. بنابراین، مهارکننده‌های پروتئازوم و MAP کیناز (MEK) می‌توانند به صورت هم‌افزایی برای کاهش تکثیر سلول‌های تومور تجویز شوند (Wang X. و همکاران، ۲۰۲۲).
CRISPR/Cas9 همچنین برای غربالگری از دست دادن عملکرد ژن منجر به مقاومت TNBC استفاده شده است (Shu و همکاران، 2020). Ge و همکاران مکانیسم مقاومت دارویی سلول‌های سرطانی تحت درمان با JQ1، یک مهارکننده برومودومین BET (BBDI)، را در TNBC توضیح دادند. با استفاده از CRISPR/Cas9، آنها دریافتند که حذف ژن rb1 باعث می‌شود TNBC در برابر داروی ضد سرطان JQ1 مقاوم شود. بنابراین، عملکرد rb1 در پاسخ به داروهای JQ1 در TNBC مهم است. آنها همچنین گزارش دادند که پاکلیتاکسل یک مهارکننده کیناز/میکروتوبول CDK4/6 است و ترکیب آن با BBDIهایی مانند JQ1 ممکن است پاسخ‌های درمانی امیدوارکننده‌ای به TNBC مقاوم به دارو ارائه دهد (Ge و همکاران، 2020).
گزارش شده است که چشم‌انداز رونویسی RNA غیرکدکننده طولانی (lncRNA) مسئول مقاومت در برابر درمان نئوادجوانت در TNBC است. این مطالعه نشان می‌دهد که پنج رونوشت lncRNA مختلف MALAT1 در TNBC به میزان زیادی بیان می‌شوند. علاوه بر این، حذف MALAT1 با واسطه CRISPR/Cas9 حساسیت سلول‌های TNBC BT-549 را به پاکلیتاکسل و دوکسوروبیسین افزایش داد، که نشان‌دهنده نقش بالقوه مقاومت MALAT1 در TNBC است (Shaath و همکاران، 2021).
جهش‌ها در BRCA1 (BRCA1m) ناهمگن هستند و بنابراین تشخیص آنها دشوار است. هدف قرار دادن PARP1 (پلی‌مراز پلی‌آدیپید ریبوز)، شریک کشنده مصنوعی BRCA1، ممکن است حساسیت شیمیایی TNBC به دارو را افزایش دهد. با استفاده از CRISPR/Cas9، حذف PARP1 حساسیت داروهای ضد سرطان مانند دوکسوروبیسین، جمسیتابین و دوستاکسل را به سلول‌های TNBC جهش‌یافته mBRCA1 افزایش داد، که نشان می‌دهد PARP1 در مقاومت دارویی در TNBC نیز نقش دارد (Vaghari-Tabari و همکاران، 2022). جهش در ژن‌های سرکوب‌کننده تومور BRCA1 یا BRCA2 احتمال ابتلا به سرطان سینه را در افراد افزایش می‌دهد. درمان این بیماران نیاز به استفاده از مهارکننده‌های PARP دارد. علاوه بر این، نشان داده شده است که حذف فاکتور نجات نوکلئوتیدی DNPH1 با استفاده از CRISPR/Cas9 می‌تواند نوکلئوتید سمی 5-هیدروکسی متیل دئوکسی یوریدین (hmdU) مونوفسفات را حذف کند و در نتیجه پاسخ سلول‌های دارای نقص BRCA را به حساسیت به مهارکننده‌های PARP افزایش دهد (Fugger. et al., 2021). بنابراین، مهارکننده‌های CRISPR/Cas9 و PARP1 ممکن است به یک استراتژی درمانی مهم برای TNBC تبدیل شوند.
ژن گلیکوپروتئین نفوذکننده (P-gp) یک ژن مقاومت چند دارویی است که عموماً در تقریباً 41٪ از کل سرطان‌های سه‌گانه پستان (TNBC) افزایش بیان دارد (Sun و همکاران، 2020). خروج دارو ناشی از P-gp به عنوان یک تنظیم‌کننده کلیدی مقاومت دارویی در سرطان پستان شناسایی شده است. مهارکننده‌های P-gp حساسیت بیشتری به داروهای ضد سرطان در سرطان پستان نشان داده‌اند (Famta و همکاران، 2021). بنابراین، حذف یا سرکوب مهارکننده‌های P-gp و P-gp با واسطه CRISPR/Cas9 ممکن است روش‌های بسیار مهمی برای غلبه بر مقاومت دارویی در سرطان‌های سه‌گانه پستان (TNBC) باشد.
انتقال‌دهنده کاست متصل به ATP G2 (ABCG2) به عنوان عامل مقاومت دارویی در TNBC شناخته شده است (Palasuberniam و همکاران، 2015)، اگرچه در حال حاضر هیچ گزارشی در مورد رابطه بین خاموش کردن CRISPR/Cas9 و ABCG2 و غیرفعال کردن ژن سرکوبگر تومور وجود ندارد. PTEN ممکن است فعال‌سازی ABCG2 را افزایش دهد (Palasuberniam و همکاران، 2015)، (Deepak Singh و همکاران، 2021). بنابراین، استفاده از CRISP/Ca9 برای حذف ABCG2 و ترکیب آن با یک مهارکننده ABCG2 ممکن است درمان مناسبی برای غلبه بر مقاومت دارویی در TNBC باشد. جدول 2 به هدف قرار دادن تمام ژن‌های مقاومت توسط CRISPR/Cas9 اشاره می‌کند.
جدول 2. CRISPR/Cas9 ژن‌های مختلف مقاومت TNBC را هدف قرار می‌دهد تا سلول‌ها را به داروهای ضد سرطان حساس کند.
کتابخانه‌های CRISPR/Cas9 ابزارهای بالقوه‌ای برای غربالگری جهش‌های ژنی مرتبط با پاتوژنز سرطان هستند (Chan et al., 2022). این روش غربالگری شامل چهار مرحله مانند (الف) ساخت کتابخانه، (ب) انتقال لنتی‌ویروسی، (ج) غربالگری فنوتیپی و (د) تجزیه و تحلیل ژن هدف است. اگرچه TNBC فعال‌سازی غیرطبیعی مسیر MAPK دارد، پیش‌آگهی بالینی درمان هدفمند MEK برای بیماران TNBC که حامل جهش در ژن‌های سرکوب‌کننده تومور مانند PTEN، RB1 و TP53 هستند، بسیار ضعیف است.
علاوه بر این، یک غربالگری حذف ژن با استفاده از CRISPR/Cas9، قوی‌ترین و انتخابی‌ترین مولکول، دهیدروکاترول، که در عصاره‌های گل و برگ گواتمالا فراوان است را آزمایش کرد تا اثر دهیدروکاترول را بر MDA-MB-231 درک کند. مکانیسم‌های سمیت سلولی انتخابی. ویژگی‌های بنیادی مزانشیمی زیرگروه‌های TNBC. این غربالگری مبتنی بر CRISPR/Cas9 همچنین نشان داد که HSD17B11، ژنی که 17β-هیدروکسی استروئید دهیدروژناز نوع 11 را کد می‌کند، در سلول‌های MDA-MB-231 به میزان زیادی بیان می‌شود و منجر به دهیدروفالکارینول اختصاصی برای سلول‌های MDA-MB-231 می‌شود (Grant و همکاران، 2020). بنابراین، این نشان می‌دهد که غربالگری ژنومی CRISPR/Cas9 پتانسیل بالایی در شناسایی مکانیسم‌های اساسی خواص ضد سرطانی ترکیبات طبیعی بالقوه دارد.
علاوه بر این، آسیب‌پذیری TNBC در برابر سرطان با استفاده از یک غربالگری بی‌طرفانه ژنومی در داخل بدن با CRISPR/Cas9 مورد مطالعه قرار گرفت که ارتباط بین مسیرهای سرطان‌زا و سرکوب‌کننده تومور را نشان داد. گزارش شده است که اجزای کلیدی مسیرهای mTOR و Hippo نقش‌های مهمی در تنظیم تومور در TNBC ایفا می‌کنند. علاوه بر این، مطالعات نشان داده‌اند که مهار دارویی mTORC1/2 و انکوپروتئین YAP به طور مؤثر بیماری‌زایی TNBC را با استفاده از یک مدل هم‌افزایی دارو-ماتریکس در شرایط آزمایشگاهی و زنوگرافت‌های مشتق از بیمار در داخل بدن مهار می‌کند. علاوه بر این، مهار mTORC1/2 با واسطه Torin-1 ماکروپینوسیتوز را افزایش می‌دهد، در حالی که مهار YAP ناشی از verteporfin منجر به مرگ سلولی TNBC می‌شود. در مجموع، این نتایج قدرت و استحکام غربالگری CRISPR در داخل بدن در سطح ژنوم را برای شناسایی درمان‌های جدید و مؤثر برای TNBC برجسته می‌کند (Dai و همکاران، 2021).
اختلال در تنظیم سیستم ایمنی عامل مهمی در تومورزایی است. سلول‌های سرطانی با دور زدن مکانیسم‌های دفاعی، از جمله تداخل در فعالیت سلول‌های ایمنی در ریزمحیط تومور و به خطر انداختن سیستم ایمنی، از پاکسازی ایمنی فرار می‌کنند. بنابراین، ایجاد یک سیستم ایمنی بهبود یافته ممکن است یک رویکرد کلیدی برای مبارزه با تومورها باشد. استفاده از اصلاح ژن مبتنی بر CRISPR/Cas9 به چندین مسئله مربوط به اختلال عملکرد ایمنی از دیدگاه‌های مختلف می‌پردازد. CRISPR/Cas9 برای بهبود ایمنی ضد توموری در برابر سرطان پستان از طریق مسیرهای زیر استفاده شده است (شکل 3).
شکل 3. ایمونوتراپی CRISPR/Cas9 سلول‌های TNBC را هدف قرار می‌دهد. از دست دادن CDK5 و مهار PDL1 و CD155 سیستم ایمنی را تقویت می‌کند. به همین ترتیب، از دست دادن A2AR و مهار TAAها مانند HER2، mucin 1 و TEM8 کارایی سلول‌های CAR-T را در کشتن سلول‌های سرطانی افزایش داد. غربالگری سلول‌های T مبتنی بر CRISPR/Cas9 نشان داده است که اختلال در کیناز p38 فعالیت ضد توموری سلول‌های T را افزایش می‌دهد. سلول‌های T اصلاح شده توسط CRISPR/Cas9 بیان TCR (گیرنده سلول T) را افزایش می‌دهند و در نتیجه سلول‌های T فعالیت ضد توموری دارند.
هدف ایمونوتراپی تحریک سیستم ایمنی برای حمله به سلول‌های سرطانی است. بیان بیش از حد پروتئین‌های ایست بازرسی ایمنی معمولاً از واکنش‌های خودایمنی جلوگیری می‌کند، اما ممکن است به سرطان‌ها کمک کند تا از آنها اجتناب کنند (Topalian و همکاران، ۲۰۱۵). این پروتئین‌ها با اتصال به گیرنده‌های روی سطح سلول‌های ایمنی، از واکنش‌های ایمنی جلوگیری می‌کنند. چندین پروتئین ایست بازرسی (مانند CD155 و PD-L1) گیرنده PD-1 را روی سلول‌های ایمنی هدف قرار می‌دهند و در سرطان سینه، به ویژه TNBC، بیان می‌شوند (Li Y.-C. و همکاران، ۲۰۲۰). مهار PD-L1 یا گیرنده آن با استفاده از CRISPR/Cas9 می‌تواند سیستم ایمنی را برای حمله به تومورهای TNBC تحریک کند (Yahata و همکاران، ۲۰۱۹). علاوه بر این، نشان داده شده است که کاهش بیان PD-L1 از طریق حذف CDK5 با واسطه CRISPR/Cas9، رشد تومور را در شرایط آزمایشگاهی (in vitro) و درون تنی (in vivo) مهار می‌کند (Deng و همکاران، ۲۰۲۰). مهار رشد در مدل‌های آزمایشگاهی (in vitro) و درون‌تنی (in vivo) سرطان سینه نشان می‌دهد که کاهش CD155 با واسطه shRNA ممکن است اثر درمانی بر سرطان سینه داشته باشد (Gao و همکاران، ۲۰۱۸).
سلول‌های CAR T، CARهایی را بیان می‌کنند که آنتی‌ژن‌های مرتبط با تومور (TAA) را شناسایی می‌کنند و می‌توانند از مهار پروتئین‌های ایست بازرسی برای افزایش فعالیت خود استفاده کنند (Li C. و همکاران، 2020). اهداف بالقوه مختلفی برای درمان با سلول‌های CAR T در سرطان پستان وجود دارد، از جمله چندین TAA مانند HER2، mucin1 و TEM8 (Bajgain و همکاران، 2018). شواهدی وجود دارد که نشان می‌دهد سلول‌های CAR T که مزوتلین (که در سلول‌های TNBC BT-459 بیش از حد بیان می‌شود) را هدف قرار می‌دهند، هنگامی که PD-1 با استفاده از CRISPR/Cas9 مهار می‌شود، در برابر سرطان مؤثرتر هستند (Hu و همکاران، 2019). با این حال، جداسازی سلول‌های T از بیماران و سپس ویرایش آنها در خارج از بدن، فرآیندی پرزحمت و زمان‌بر است. اگرچه سلول‌های T عمومی می‌توانند نیازهای جداسازی را کاهش دهند، سلول‌های T اهداکننده که آنتی‌ژن لکوسیت انسانی (HLA) کلاس I و گیرنده سلول T (TCR) را بیان می‌کنند، باید برای جلوگیری از ناهنجاری‌های پیوند علیه میزبان حذف شوند (Ren et al., 2017). ، 2017a). با استفاده از CRISPR/Cas9، HDR می‌تواند به طور همزمان TCR و HLA را حذف کرده و ژن کدکننده CAR را از کار بیندازد. مطالعات نشان داده‌اند که CRISPR/Cas9 می‌تواند برای معرفی CARهای ضد CD19 به جایگاه TCR استفاده شود و در نتیجه CARها را بدون کاهش سلول‌های T به طور مؤثر تولید کند (Dimitri et al., 2022). فناوری‌های چندگانه برای تولید سلول‌های T CAR آلوژنیک با حذف همزمان TCR، بتا-2-میکروگلوبولین (B2M)، زیر واحد HLA-I و سایر پروتئین‌ها مانند PD-1 و CTLA-4، که ممکن است خواص ضد سرطانی بیشتری داشته باشند، توسعه یافته‌اند. علیه TNBC (Eyquem و همکاران، 2017؛ لیو و همکاران، 2017؛ رن و همکاران، 2017b؛ دیمیتری و همکاران، 2022).
استفاده از CRISPR/Cas9 می‌تواند اثربخشی سلول‌های CAR-T را بهبود بخشد. آدنوزین به داشتن خواص سرکوب‌کننده سیستم ایمنی معروف است و می‌تواند با مسدود کردن عملکرد سلول‌های T و فعال کردن گیرنده‌های آدنوزین A2A (A2AR) ایمنی ضد سرطانی را کاهش دهد (Vigano و همکاران، 2019). خاموش کردن A2AR با استفاده از CRISPR/Cas9 به طور قابل توجهی اثربخشی سلول‌های CAR-T را در داخل بدن بهبود بخشید (Giuffrida و همکاران، 2021). سلول‌های T به داشتن ویژگی‌های فنوتیپی مختلف مانند گسترش سلولی، تمایز، استرس اکسیداتیو و استرس ژنومی شناخته شده‌اند. غربالگری سلول‌های T مبتنی بر CRISPR/Cas9 اختلال در 25 کیناز گیرنده سلول T مختلف را نشان داد. در میان آنها، نشان داده شده است که حذف کیناز p38 فعالیت ضد توموری سلول‌های T را افزایش می‌دهد، که نشان می‌دهد کیناز p38 یک تنظیم‌کننده کلیدی تنظیم سلول‌های CAR-T است (Gurusamy و همکاران، 2020).
سلول‌های T را می‌توان با استفاده از CRISPR/Cas9 از نظر ژنتیکی اصلاح کرد تا TCRهای با بیان بالا تولید کنند. انتقال سلول‌های T اصلاح‌شده ژنتیکی به بیماران، فعالیت ضد سرطانی قوی‌تری نسبت به سلول‌های T درون‌زا نشان داده است. بنابراین، TCRهای درون‌زا ممکن است با TCRهای تغییریافته ژنتیکی در بیماران رقابت کنند، که ممکن است بر پتانسیل ایمونوتراپی سرطان تأثیر بگذارد. برای غلبه بر این مشکل، استفاده از CRISPR/Cas9 برای حذف TCR-β درون‌زا در سلول‌های گیرنده و متعاقباً انتقال سلول‌های T TCR-β به بیماران سرطانی ممکن است پاسخ‌های ایمنی ضد سرطانی بهتری را بدون نیاز به رقابت جنسی TCR درون‌زا نشان دهد (Fan et al. 2018). بنابراین، به استثنای سلول‌های T اصلاح‌شده با CRISPR، TCRها هزار برابر بیشتر از سلول‌های T طبیعی منتقل‌شده با TCR به آنتی‌ژن‌های تومور حساس هستند. علاوه بر این، در انواع لوسمی‌ها، سلول‌های T تغییریافته تولید شده توسط γδ TCR+ CRISPR بیان بالاتری از سلول‌های T CD4+ و CD8+ نسبت به انتقال TCR استاندارد نشان می‌دهند (Legut et al., 2018). بنابراین، سلول‌های T اصلاح‌شده تولید شده توسط CRISPR/Cas9 ممکن است یک روش ایمونوتراپی مؤثر برای غلبه بر TNBC باشند.
اینتگرین‌ها مولکول‌های چسبندگی سلولی هستند که در غشاهای سلولی وجود دارند و اتصال سلول‌ها به ماتریکس خارج سلولی (ECM) را تقویت می‌کنند (Hamidi and Ivaska, 2018). اختلال در تنظیم اینتگرین‌ها با تغییر ماتریکس خارج سلولی با توسعه و مهاجرت سرطان مرتبط است و منجر به بقای سلول‌های سرطانی در گردش خون می‌شود (Hamidi and Ivaska, 2018). مهار اینتگرین با واسطه CRISPR/Cas9 پیشرفت تومور، متاستاز و کلونیزاسیون را در TNBC کند می‌کند. گزارش شده است که مهار اینتگرین a5 (ITGA5) مهاجرت و پیشرفت سلولی را در سایر سرطان‌ها مانند سرطان ریه کاهش می‌دهد (Ju et al., 2017)، که نشان می‌دهد اینتگرین a5 همچنین ممکن است یک عامل کلیدی در پاتوژنز TNBC باشد.
تولید موش‌های ناک‌اوت با استفاده از روش‌های سنتی سلول‌های بنیادی جنینی (ES) فرآیندی پرزحمت، زمان‌بر و ناکارآمد است. هدف قرار دادن سلول‌های ES از طریق نوترکیبی همولوگ، پرورش موش‌های کایمریک و سپس تلاقی آنها با موش‌های هتروزیگوت برای تولید فرزندان هموزیگوت، ماه‌ها و سال‌ها طول می‌کشد. برای ایجاد موش‌هایی با جهش‌های ژنتیکی متعدد، تلاقی پیچیده‌ای لازم است. با این حال، هنگام استفاده از موش‌های تولید شده با حذف سلول‌های ES با استفاده از CRISPR/Cas9 یا با تزریق اجزای CRISPR/Cas9 به تخمک‌های لقاح‌یافته تک سلولی، مشکلات زیادی ایجاد شده است. به عنوان مثال، ایجاد تغییرات اغلب در جایگاه‌های دو آللی رخ می‌دهد و مختص ژن نیست. اخیراً گزارش شده است که سلول‌های ES با استفاده از فناوری CRISPR/Cas9 می‌توانند به طور همزمان جهش‌های دو آللی را در حداکثر 5 ژن وارد کنند (Nishizono و همکاران، 2021). برای این منظور، mRNAی Cas9 و پنج gRNA اختصاصی ژن به طور همزمان به سلول‌های ES منتقل شدند. این امر نویدبخش و مؤثر بودن این روش را برجسته می‌کند، اگرچه این جهش‌ها ممکن است زمانی که رده‌های بنیادی برای تولید موش‌های پنج‌گانه ناک‌اوت پرورش داده شدند، منتقل شده باشند. این مطالعه همچنین از یک کشف شگفت‌انگیز خبر می‌دهد: سلول‌های ES دیگر برای ایجاد موش‌های اصلاح‌شده ژنتیکی مورد نیاز نیستند. در عوض، برای حذف محصولات ژنی خاص، mRNA و gRNA Cas9 به جنین‌های مرحله تک سلولی تزریق شدند. در نتیجه، رده‌های بنیادی ناک‌اوت ایجاد شده‌اند که از نظر تئوری می‌توانند برای مطالعه عواقب حذف ژن در موش‌ها مورد استفاده قرار گیرند (Qin et al., 2016). بنابراین، CRISPR/Cas9 امکان ایجاد موش‌های تراریخته برای درمان TNBC را با هزینه کمتری نسبت به مهندسی ژنتیک سنتی فراهم می‌کند. با استفاده از سیستم CRISPR/Cas، یک مدل موش ناک‌اوت جدید توسعه داده شده است که می‌تواند با موفقیت جهش‌های نقطه‌ای را در یک یا چند ژن درون‌زا در TNBC ایجاد کند. بر اساس این مفهوم، مدل‌های حیوانی TNBC را می‌توان با استفاده از حذف BRCA1 و p53 با واسطه CRISPR/Cas9 نیز توسعه داد که منجر به از دست رفتن ترمیم HR، بی‌ثباتی ژنومی و فنوتیپ‌های جهش‌یافته می‌شود (Annunziato و همکاران، 2020).
در حال حاضر، روش‌های مختلفی مانند ماموگرافی، تصویربرداری رزونانس مغناطیسی (MRI) و سونوگرافی برای تشخیص TNBC استفاده می‌شود. با این حال، این روش‌ها محدودیت‌هایی دارند. ماموگرافی برای تشخیص بافت موضعی پستان به جای متاستازها، که در آن سلول‌های سرطانی به اندام‌های دیگر مهاجرت کرده‌اند، استفاده می‌شود. سونوگرافی روش قابل اعتمادی برای تشخیص TNBC نیست (Chen and Lee-Felker, 2023). MRI حساسیت بالاتری نسبت به سونوگرافی و ماموگرافی دارد، اما دقت تشخیصی آن محدود است (Sha and Chen, 2022). بیوپسی بافت یک روش تهاجمی برای شناسایی سلول‌های سرطانی است. با این حال، در برخی موارد، اگر سوزن از ناحیه مورد نظر منحرف شود، ممکن است بافت سرطانی در بیوپسی از دست برود. علاوه بر این، بسیار گران است و می‌تواند برای بیمار آسیب‌زا باشد. TNBC نوعی سرطان ناهمگن است، بنابراین بیوپسی ممکن است اطلاعات کافی در مورد نوع سرطان ارائه ندهد. بنابراین، یک روش تشخیصی جدید و قابل اعتماد برای تشخیص TNBC به شدت مورد نیاز است. CRISPR/Cas9 می‌تواند به عنوان یک جایگزین بسیار حساس و کم تهاجمی برای تشخیص سرطان سینه عمل کند. برای این منظور، می‌توان از استراتژی‌های مبتنی بر CRISPR/Cas9 برای بهبود روش‌های PCR برای تشخیص TNBC استفاده کرد. ابتدا، پروتئین‌های Cas9 و cpf1 سیستم CRISPR برای حذف DNA غیر اختصاصی استفاده می‌شوند و سپس این دو پروتئین (Cas9 و cpf1) می‌توانند توالی PAM را قبل از اتصال به DNA هدف تشخیص دهند (Deepak Singh و همکاران، 2021). بنابراین، PCR می‌تواند جهش‌های مرتبط با توسعه سرطان را شناسایی کند. چندین مطالعه این استراتژی مبتنی بر CRISPR را برای تشخیص جهش‌های مختلف در سرطان‌های مختلف اتخاذ کرده‌اند (Safari و همکاران، 2019). بنابراین، روش‌های PCR مبتنی بر CRISPR ممکن است وابستگی تشخیص TNBC به روش‌های تهاجمی مانند ایمونوهیستوشیمی مبتنی بر بیوپسی را کاهش دهند.
تغییرات ژنوتیپی در تنظیم گیرنده هورمونی نیز در TNBC نشان داده شده است (Chen and Russo, 2009). استراتژی‌های PCR مبتنی بر CRISPR/Cas9 با استفاده از ریزآرایه‌ها برای تشخیص در محل مراقبت می‌توانند به طور مؤثر این جهش‌ها را رصد کنند (Hajian et al., 2019). همچنین می‌تواند اطلاعات مرتبطی در مورد جهش‌های خاص در بیماران TNBC در اختیار ارائه دهندگان خدمات درمانی قرار دهد که می‌تواند به بهبود روند درمان آنها کمک کند. با این حال، این تکنیک ترکیبی محدودیت‌هایی دارد. بنابراین، قبل از اینکه بتوان از این روش CRISPR/Cas-PCR در مراقبت‌های بهداشتی برای تشخیص TNBC استفاده کرد، تلاش‌های تحقیقاتی گسترده‌ای مورد نیاز است (Yang et al., 2019).